5. Ca²⁺シグナルと膜輸送体の発現および機能調節

2000年9月28日−9月29日
代表：河原克雅（北里大・医・生理)
世話人：宮崎俊一（生理研)

（１）

2光子励起法による外分泌腺開口放出の研究
根本知己*，木村良一，伊藤公一，立川　光，宮下保司,
飯野正光，河西春郎*（*生理研・生体膜，東京大・医学系研究科・薬理)

（２）

アセチルコリンによる膵β-cellの脱分極発生機構：Ca²⁺のCa²⁺流入に対するpositive feedback system
泉井　亮，菅世智子，菅野隆浩（弘前大・医・生理)

（３）

単一膵β細胞におけるインスリン分泌の解析
最上秀夫，張　恵，山田聡子，小島　至（群馬大・生体調節研)

（４）

BCRを介するカルシウムシグナルの分子的解析
黒崎知博（関西医大・肝研・分子遺伝)

（５）

マウス卵のCa²⁺ oscillationにおけるCa²⁺/Mn²⁺influx・release
毛利達磨¹，白川英樹²，尾田正二²，宮崎俊一^1,2
（¹生理研・細胞内代謝，²東京女子医大・医・第二生理)

（６）

Ca²⁺-ATPaseのチャネル活性
老木成稔，清水啓史，豊島　近（福井医大・生理，東京大・分子細胞生物研)

（７）

カルシウムシグナルのコーディングとデコーディング機構
飯野正光（東京大・医学系研究科・細胞分子薬理)

（８）

細胞の機能調節におけるプロトンチャネルの役割
久野みゆき，森畑宏一，森　啓之 (大阪市大・院・医・分子細胞生理)

（９）

恐山湖産ウグイの酸性適応機構の解明
平田　拓¹，小野俊浩¹，仲里猛留¹，猿田洋子¹，金子豊二²，平野哲也²,
若林繁夫³，重川宗一³，広瀬茂久¹
（¹東京工業大・生命理工学研・生体システム専攻，²東京大・海洋研究所，³国立循環器病センター・分子生理)

（10）

内向き整流性K⁺チャネルKir7.1の生理機能解明に向けて
鈴木喜郎，中村信大，大方香代子，藤乗嗣泰，河原克雅，広瀬茂久
（東京工業大・生命理工，東京大・医・腎臓内分泌内科，北里大・医・生理）

（11）

血管系に発現するスフィンゴシン-１-リン酸受容体群による細胞運動調節とそのシグナリング
多久和陽，岡本宏之，多久和典子，杉本直俊，櫻田惣太郎（金沢大・医・第一生理)

（12）

新規亜鉛バイオイメージングプローブ
菊地和也，平野智也，長野哲雄（東京大・大学院薬学系研究科)

（13）

“TBA”
宮脇敦史（理化学研究所・脳科学総合研究センター)

【参加者名】
　河原克雅（北里大・医），宮崎俊一，尾田正二，河内全（東京女子医大），泉井亮，菅世智子（弘前大・医），小島至，最上秀夫，山田聡子，張恵（群馬大・生体調節研），毛利達磨（生理研・細胞内代謝），菊地和也（東京大・大学院薬学系研究科），飯野正光，橋本彰子．冨田太一郎（東京大・医学系研究科），広瀬茂久，平田拓，鈴木喜郎（東京工大・生命理工学），河西　春郎，根本知己，高橋倫子（生理研・生体膜），多久和陽，龍泰治，桜井華奈子，有川佳代（金沢大・医），老木成稔（福井医科大），黒崎知博（関西医大），久野みゆき，森畑宏一，森　啓之（大阪市大・院・医・分子細胞生理），宮脇敦史，水野秀昭，日野美紀，沢野朝子（理化学研・脳科学総合研究センター・細胞機能），吉田繁（長崎大・医）

【概要】
　Ca²⁺シグナル研究会は，細胞内Ca²⁺シグナルの持つ多彩な機能調節を上回る，多能な機能研究者集団である。Ca²⁺の持つ広範な細胞機能の調節能力をいろんな角度から議論し，有益な情報を交換する。細胞内Ca²⁺振動とMn²⁺の役割，あるいは細胞内Zn²⁺イメージング技術の開発など，Ca²⁺の調節能を側面から調べる重要性を示し，Ca²⁺研究の新しい展開を予感させた。一方，Ca²⁺シグナルコーディングとデコーディングは，Ca²⁺シグナルの多彩な機能調節の仕組みを読み解く「鍵」を提示し，示唆に飛んだ内容であった。新しい実験技術の紹介と実験データの解釈を巡った質の高い議論は，元祖「Ca²⁺シグナル研究会」の魅力である。

(1) 2光子励起法による外分泌腺開口放出の研究

根本知己*，木村良一，伊藤公一，立川　光，宮下保司，飯野正光，河西春郎*
（*生理研・生体膜，東京大・医学系研究科・薬理)

　膵臓外分泌腺腺房標本の開口放出を多光子励起法を用いて可視化した所，Ω状の開口放出は元よりあった腺腔面のみでなく，既に形成されたΩ構造の上に頻繁に形成され，開口放出が連鎖的に起きる逐次開口放出が主たる開口放出の様式であることがわかった。開口放出を起こすCa²⁺振動においては5マイクロモル以上のCa²⁺濃度上昇が顆粒領域内層にまで及び，これにより内層への逐次開口放出が誘発される。一方，培養プルキンエ細胞では，カルビンディンの飽和によりマイクロモル以上のCa^2＋濃度上昇が非線型に起きる。この様に生理的な範囲のCa^2＋濃度上昇はfura-2やfluo-3を飽和させる程大きいことがあるが，in vivoのRmaxやFmaxはin vitroより小さいのでこの飽和は見逃されやすい．

(2) アセチルコリンによる膵β-cellの脱分極発生機構:
Ca²⁺のCa²⁺流入に対するpositive feedback system

泉井　亮，菅世智子，菅野隆浩（弘前大・医・第一生理)

　アセチルコリン（ACh）は，ラット膵β-cellのインスリン分泌を促進する。この過程では脱分極に伴ってβ-cellに流入するCa²⁺の役割が大きいが，AChによる脱分極発生のイオン機構やこれに関係する細胞内情報伝達機構については明らかではない．そこでこの点を電気生理学の手法を中心に検討した。その結果，1) ACh（0.01-10μM）はwhole-cell modeで記録されたATP-sensitive K⁺ channel (K_ATP) 電流を，電極液のEGTAが0.5mMのときは抑制したが，10mMでは抑制しなかった。2)AChによる電流抑制はGDPβS，U73122，heparinによって消失した。3) Inside-out modeで膜内側のCa²⁺を10nMから10μMにするとKATP活性は減少した。これらの結果から，AChによる脱分極はIP₃によって放出されるCa²⁺がKATPのATP感受性を促進することでKATP活性が低下することによると考えられる。この脱分極はL-type Ca²⁺ channelを開口してCa²⁺流入を促進する。すなわち，AChによるラット膵β-cellのCa²⁺ signalingではCa²⁺のCa²⁺流入に対する正のフィードバック機構が働いている。

(3) 単一膵β細胞におけるインスリン分泌の解析

最上秀夫，張　恵，山田聡子，小島　至（群馬大・生体調節研)

　目的：細胞内カルシウムイオン（Ca²⁺）濃度の上昇とジアシルグリセロール(DG) により活性化されるconventional PKC(cPKC)は，広範な細胞機能の調節に関与している。今回，我々はインスリン分泌細胞においてグルコースによるインスリン分泌活性化機構を細胞内Ca²⁺動態とcPKC一つであるPKCαの活性化の観点から検討した。
　方法：インスリン分泌細胞(INS-1) にPKCα-GFPを導入して，細胞質から細胞膜へのPKCα-GFPのtranslocationとインスリン分泌をPKCαの活性化の指標にした。同時にfura-2にて細胞内Ca²⁺動態をモニターした。
　結果：脱分極刺激によるCa²⁺influxにより惹起されるCa²⁺オシレーションによってPKCの活性化が起こった。PKCの活性化には400nM以上の細胞内Ca²⁺濃度上昇が必要であった。高濃度グルコース存在下でその活性化はさらに高まった。
　結論：インスリン分泌細胞においてグルコースによるPKCの活性化を介したインスリン分泌活性化機構の存在が示唆された

(4) BCRを介するカルシウムシグナルの分子的解析

黒崎知博（関西医大・肝研・分子遺伝)

　私達は既に，BCRにより誘起されるカルシウム動員にはPLC-γ2とPhoshoinositide 3-kinase (PI3K) の二つの経路が活性化されることが必須であることを明らかにしてきた。今回DT40 B細胞を用いて遺伝学的・生化学的解析を行うことにより２つのことを明らかにしてきた。１）PLC-γ2, PI3Kが活性化されるためには刺激依存性にchoresterol-richな特殊な膜各群であるGEM fractionに移行することが重要であり，アダプター分子BLNK, BCAPはその移行に必須の役割を担っている。GEM fractionにはTrp channelが豊富に存在しているという報告もなされており，GEM fractionがカルシウムシグナル発生に重要な分子群を集積する場として機能していることが予測される。２）DT40 B細胞にTrp1 channelが発現しており，この欠損細胞はERからのcalcium releaseも細胞外からのcalcium influxも阻害され，重要な機能を担っていることが示された。

(5) マウス卵のCa²⁺oscillationにおけるCa²⁺/Mn²⁺ influx・release

毛利達磨¹，白川英樹²，尾田正二²，宮崎俊一^1,2
(^１生理研・細胞内代謝，²東京女子医大・第二生理)

　ハムスター精子抽出物(SE) をマウス卵に顕微注入し受精時と同様なCa²⁺振動を起させ，Mn²⁺によるFura-2の蛍光消退を用いCa²⁺/Mn²⁺動態を測定した。細胞内Mn²⁺濃度の増加につれそれぞれのCa²⁺増加に伴うMn²⁺振動が見られた。この時Mn²⁺流入は持続的であり静止時に比べ2-3倍増大していた。この結果はCa²⁺とMn²⁺の競合的阻害条件下で，流入排出を仮定したモデルで数値的にシミュレーションできた。すなわち，細胞内に流入したMn²⁺もCa²⁺と同様にERに取り込まれさらに遊離されることを示した。イノシトール三リン酸(InsP₃) の注入による一過的なCa²⁺増加は，一過的なMn²⁺流入のみを誘起した。またCa²⁺ストアーの枯渇による顕著なMn²⁺流入は容量性Ca²⁺流入機構の存在を示唆した。結論として，マウス卵のCa²⁺振動時には最初の大きなCa²⁺遊離時に，容量性Ca²⁺流入機構により，Ca²⁺流入が引き起こされ，持続的なCa²⁺流入が継続されることがわかった。

(6) Ca²⁺-ATPaseのチャネル活性

老木成稔・清水啓史・豊島　近
（福井医大・生理，東京大，分子細胞生物研)

　筋小胞体Ca²⁺-ATPaseは，ある条件下ではCa²⁺の受動的な輸送路となることが筋小胞体ベシクルを用いたCa²⁺流束の実験から示されてきた。Ca²⁺-ATPaseの一次構造上，ポンプ活性に関わる負電荷残基が同定され，これらの残基はCa²⁺チャネルの選択性フィルター部に相同な構造を持つ．Ca²⁺-ATPaseの受動輸送機構を明らかにするために精製Ca²⁺-ATPaseを用いて実験を行った。精製Ca²⁺-ATPaseをリポソームに再構成し，pyrane maleimide (PMI：システイン残基修飾剤)で修飾するとCa²⁺流束が著明に増大した。脂質平面膜に再構成し電圧固定法でイオン電流を測定した。電位ステップによって時間非依存性電流が測定でき，その電流−電圧特性は弱い整流性を示した。この電流は流束実験に一致して，thapsigarginやCa²⁺で抑制された。Ca²⁺-ATPaseの立体構造をもとにCa²⁺の透過機構について検討する。

(7) カルシウムシグナルのコーディングとデコーディング機構

飯野正光（東京大学医学系研究科・細胞分子薬理)

　細胞内カルシウムシグナルは，カルシウムウエーブ・オシレーションといった時間的・空間的ダイナミズムを示し細胞機能を制御している。細胞に対する入力に応じてカルシウムシグナルがどのようにコードされるか，またそれが細胞機能へどのようにデコードされるかは，細胞の生理機能制御を理解するうえで基本的に重要な問題である。多種の細胞応答では，細胞内イノシトール三リン酸（IP₃）に引き続いてカルシウムシグナルが生じる。このコーディング機構においてカルシウムシグナルが，自身の形成機構にフィードバックをかけることが重要であることを我々は示してきた。すなわち，IP₃受容体自身及びIP₃産生機構に対するフィードバック効果である。このメカニズムの分子レベルの解明が進んでいる。さらに，複雑なカルシウムシグナルをデコードするメカニズムについて，カルシウム依存性転写因子であるNF-ATについて解析を進めたところ，特徴的な検出機構があることが明らかになってきた。

(8) 細胞の機能調節におけるプロトンチャネルの役割

久野みゆき，森畑宏一，森啓之（大阪市大・院・医・分子細胞生理)

　膜電位依存性プロトン（H⁺）チャネルは，脱分極によって開口し短時間に大量のH⁺排出能をもつユニークなpH調節機構である。中枢神経系のphagocyteであるミクログリア,骨組織のH⁺分泌細胞である破骨細胞，ヒスタミン分泌細胞であるマスト細胞はいずれもH⁺チャネルを発現している。通常はpHの変動によるfeedback機構で制御されているが，いずれの細胞でもH⁺チャネル電流量はphenotypeによって大きく異なり,また記録中に電流量のfluctuationが見られるなど，チャネル活性は細胞内外の環境に鋭敏に反応して変動する。起電性H⁺-ATPaseのH⁺-translocation能を担うc-subunitと比較すると，H⁺チャネルは細胞内アシドーシスからの迅速な回復に威力を発揮した。

(9) 恐山湖産ウグイの酸性適応機構の解明

平田　拓¹，小野俊浩¹，仲里猛留¹，猿田洋子¹，金子豊二²
平野哲也²，若林繁夫³，重川宗一³，広瀬茂久¹
（¹東工大・生命理工，²東大・海洋研，
³国立循環器病センター・研・分子生理）

　恐山（青森）のカルデラ湖に生息するウグイはpH3.5 という極めて過酷な硫酸酸性に適応する能力を持つ．この恐山ウグイの酸性適応機構解明の手がかりを得るために，外界とのイオン輸送に重要な役割を果たしていると考えられる鰓で，H^＋とHCO₃^- の輸送がどのように行われているかを，各々のイオン輸送を行っていると考えられるNa⁺/H⁺ exchanger 3 (NHE3) Na^＋/HCO₃^-cotransporter (NBC) に注目し調べた。ノーザン解析より，酸性適応にともない NHE3とNBCの発現量が顕著に増大しており，また，免疫組織染色より，NHE3は塩類細胞の頂端部に，NBCは基底膜側に特異的に発現していることを確かめた。鰓の塩類細胞において，NHE3は外界からNa^＋を取り込むのと交換でH⁺ を排出し，NBCは取り込まれたNa^＋と一緒にpH緩衝剤として働くHCO₃^- を血中に送り込むことで，効率よく血液及び体液の酸性化を防ぎ，生存を計っているものと推定される。

(10) 内向き整流性K^＋チャネル Kir7.1の生理機能解明にむけて

鈴木喜郎^1,3)，中村信大¹⁾，大方香代子¹⁾,
藤乗嗣泰²⁾，河原克雅³⁾，広瀬茂久¹⁾
（¹⁾東工大・生命理工 ²⁾東大・医・腎臓内分泌内科
³⁾北里大・医・生理)

　内向き整流性K⁺チャネルKir7.1は，近年ESTデータベースより同定され，特徴的なポア配列を持つこと，および甲状腺，小腸粘膜，脈絡叢などに発現していることから，新しい上皮型K⁺チャネルとして注目されている。今回私達は，このK⁺チャネルが細胞のどのような要求によって発現してくるのかを明らかし，その生理機能を推定するために，ラットKir7.1遺伝子とそのプロモーター領域の解析を行った。その結果，細胞内cAMP上昇により転写活性が増加した。さらに，甲状腺由来細胞株FRTL-5において，TSH刺激により内在性Kir7.1のmRNAおよびタンパク量が増加した。これらのことからKir7.1は甲状腺機能そのものに関与することが強く示唆され，ヨード輸送の際のK⁺リサイクルを行っているのではないかと推測された。

(11) 血管系に発現するスフィンゴシン-１-リン酸(S1P)受容体群による
細胞運動調節とそのシグナリング

多久和陽，岡本宏之，多久和典子，杉本直俊，櫻田惣太郎
(金沢大・医・第一生理)

　私達が以前に血管平滑筋よりクローニングしたOrphan Gタンパク共役型受容体AGR16/EDG5は，生理活性脂質S1Pに対する受容体であることを見い出した。S1Pは様々な細胞の増殖・分化・骨格・運動・サバイバル，平滑筋トーヌスなどに影響する。S1Pは血漿中に高濃度で存在し，また様々な活性化細胞によって細胞外に放出される。EDG5は8つのメンバーからなるEDGファミリーに属するが，EDG1, EDG3, EDG8はEDG5と同様にS1P受容体であり，これに対してEDG2, EDG4, EDG7はLPA受容体であることが明らかとなった。EDG1,3,5はいずれもG_iもしくはG_qを介してPLC/Ca²⁺/DAG, MAPK系に共役するが，Rhoファミリー低分子量Gタンパクへの共役はEDG受容体サブタイプによって様々に異なり，その結果細胞運動におよぼす作用が全く異なる。

(12) 新規亜鉛バイオイメージングプローブ

菊地和也・平野智也・長野哲雄 (東大・院薬)

　細胞の内外に存在する遊離のZn²⁺が細胞死や神経伝達に関与していることが報告されてきたが，その動態，作用機序に関しては仮説の段階である。そこで我々は，生理的条件下で瞬時に反応する可視光励起型蛍光プローブ分子の開発を行った。Zn²⁺のアクセプターとしてZn²⁺と瞬時に選択的に結合するTPEN類を選択し，蛍光団としてfluorescein類を用いた蛍光プローブ(ZnAF-1，ZnAF-2) をデザイン・合成した。Zn²⁺を加えることにより，ZnAF-1，ZnAF-2ともに極大励起波長(492 nm) 及び極大蛍光波長(514 nm) は変化せず，蛍光強度は容量依存的にかつ瞬時に増大した。中性付近のpHでは蛍光強度は安定した。Ca²⁺等の生体内に存在する金属イオンを加えても，蛍光強度は変化せず，これらの金属イオンとZn²⁺を共存させてもほとんど影響を与えなかった。細胞応用についても報告する。

(13) “TBA”

宮脇敦史（理化研脳科学総合研究センター細胞機能探索技術開発チーム)

　GFPをベースにCa²⁺指示薬を作製する際の，２つのアプローチを報告する。第１に，オワンクラゲGFPのmutantの一つであるサファイアをドナー，六放サンゴから得られたRFPをアクセプターにすると非常に効率のよいFRETが実現できることを見出した。サファイア，RFPを組み込んで作製されたRed cameleonは，pH変化が激しく起こる神経細胞でのCa²⁺イメージングに適することが示された。第２にGFPのβ- can構造にメスを入れたものに，Ca²⁺センサーとしてのカルモデュリンとその標的ペプチドを組み込み，Ca²⁺濃度に従って蛍光特性を変えるGFP‘pericam’を創り出した。Ca²⁺によって蛍光強度が増大する‘flash-pericam’，蛍光強度が減少する‘inverse-pericam’，色が変わる２波長励起１波長測光型の‘ratiometric-pericam’がある。

Copyright(C) 2002 National Institute for Physiological Sciences