脳機能計測センター

形態情報解析室

【概要】
　形態情報解析室は，形態に関連する超高圧電子顕微鏡室（別棟）と組織培養標本室（本棟2F）から構成される。超高圧電子顕微鏡室では，医学生物学用超高圧電子顕微鏡（H-1250M型；常用1,000ｋV）を，昭和57年3月に導入して同年11月よりこれを用いての共同利用実験が開始されている。平成13年度は共同利用実験計画が20年目に入った。本研究所の超高圧電顕の特徴を生かした応用研究の公募に対して全国から応募があり，平成13年度は最終的に12課題が採択され，そのうち11課題が実施された。これらは，厚い生物試料の立体観察と三次元解析，薄い試料の高分解能観察等である。共同利用実験の成果は，超高圧電子顕微鏡共同利用実験報告の章に詳述されている。超高圧電子顕微鏡室では，上記の共同利用実験計画を援助するとともに，これらの課題を支える各種装置の維持管理及び開発，医学生物学用超高圧電子顕微鏡に関連する各種基礎データの集積および電子顕微鏡画像処理解析法の開発に取り組んでいる。電子線トモグラフィーによる手法では，UCSD, NCMIRによる方法及びコロラド大で開発されたIMOD プログラムでの方法を用いて解析を進めている。本年度の超高圧電顕の利用状況の内訳は，共同利用実験等 113日，修理調整等67日である（技術課脳機能計測センター形態情報解析室報告参照）。電顕フィルム等使用枚数は5,732 枚，フィラメン点灯時間は388.8時間であった。装置は，平均63 ％の稼働率で利用されており，試料位置で10⁻⁶Pa台の高い真空度のもとに，各部の劣化に伴う修理改造を伴いながらも，高い解像度を保って安定に運転されている。
　組織培養標本室では，通常用およびP2用の培養細胞専用の培養機器と，各種の光学顕微鏡標本の作製および観察用機器の整備に勤めている。平成13年度の利用者は所内7部門28名，所外 2名であった。

超高圧電子顕微鏡（H-1250M）による立体写真の配置に関して

有井達夫

　医学生物学用としての超高圧電子顕微鏡（H-1250M）は，出来るだけ低倍（×1,000）において，厚い試料の広い視野を，高解像度に撮影できることが重要である。1996年に実施した低倍を重視した対物レンズの改造に伴い，現在，傾斜軸は，フィルムの長辺に対して約10度傾斜しているとしたが，今回検討したところ1kから45kの低倍においてZ補正の後には約5度であった。このときに，超高圧電子顕微鏡（H-1250M）で撮影したフィルムの立体写真を，観察するにあたっては，図1のようにフィルムを配置し平行視することによって，電子顕微鏡のサイドエントリー傾斜台の試料位置に設置された試料を，平行視の条件で，直接蛍光板側から試料を観察したときに見える像となる。このとき，右目用の像は，+θ ° (θ＞0)で撮影したもの，左目用の像は-θ ° (θ＞0)で撮影したものである。図1のように，約5度傾斜させて配置すれば，最適な立体視の条件となる。また左右の写真において，中央近くの対応点を重ね合わせ全ての他の対応点の間を結ぶときの（視差を検出する）方向と垂直に傾斜軸が存在することになる。

図1 　HVEM(H-1250M) による立体写真（平行視）の配置

ラット膵臓導管におけるAQP1の局在

古家　園子
成瀬　達（名古屋大学・医学部・第２内科）

　【目的】
　血管や腎臓，消化管などにおいては各種類の水チャンネルが局在し，大量の水の移動に重要な役割を果たしている。膵臓の導管では多量のHCO₃イオンを含む水分泌が行われており，ラット膵臓から単離した小葉間導管ではAQP1のmRNAがRT-PCR法にて検出されているので，今回，in vivo におけるAQP1の局在を光顕および電顕免疫組織化学で検討した。
　【方法】
　6週齢のWisterおよびSDラットを4%paraformaldehyde /0.1% glutaraldehyde/0.2% picric acid/0.1M phosphate buffer (pH 7.2) にて潅流固定し，cryoprotect後，凍結切片を作成した。抗AQP1 抗体で反応後，ABC法及びストレプトアビヂンナノゴールドを用い，DAB反応及び銀増感法にて可視化した。
　【結果】
　腺房，介在部, 細い小葉内導管，主膵管はAQP1陰性であったが，大きめの小葉内導管の一部の細胞，および，小葉間導管の多くの細胞がAQP1陽性であった。AQP1は小葉内導管や細い小葉間導管では管腔側よりも基底側膜側に多く分布し，中程度以上の太さの小葉間導管では管腔側および基底側膜に強く局在していた。細胞膜のみならず，caveoleや細胞質内のvesicleの周りもAQP1陽性であった。AQP1の分布は膵臓導管の太さと密接な相関があり，小葉間導管にもっとも強く局在していることが明らかになった。

生体情報処理室

【概要】
　脳における情報処理には，ネットワークを構成している個々のニューロンの発火パターンが意味を持つデジタル的過程と，非線形素子としてのニューロンの興奮性変化が意味をもつアナログ的過程がある。後者には種々の細胞内シグナル伝達系の活性が密接に関与しており，それらの量的な違いやバランスの変化は，ニューロン回路で行われているデジタル的処理にも大きな影響を及ぼしている。それゆえ特定のニューロン・ネットワークへの入力は同様であっても，ある条件のもとでは学習・記憶の生成・保持が起こり，別の場合には成熟・老化が促進されるなど，多彩な結果が生じていると予想される。当室では，外界からの刺激または侵襲に対する，受容体の変化−細胞内の分子の動き−生化学的変化−興奮性の変化−神経機能の変化−脳機能あるいは脳機能障害の発現，という一連の過程をニューロン・ネットワーク上で総合的に捉え，脳における情報処理の基本的な仕組みを理解することを目指している。現在は，中枢ニューロンの興奮性調節メカニズムに関して，以下の3テーマを中心に研究を行っている。
　なお当室では，吉村・村田両技官が中心となり，所内共用施設として，SGIOrigin2000を核とする生体情報解析システム，および，各種所内ネットワークサービスの運用を行っている。これらについての詳細は技術課の項を参照されたい。

樹状突起活動電位の伝播調節メカニズムの解析

坪川　宏

　樹状突起は，種々のシナプス入力を統合してニューロンの出力を決定するためのADコンバーターとして，情報処理上の重要な役割を担っている。シナプス統合のメカニズムは脳内のニューロンにより異なるが，大脳皮質や海馬の錐体細胞では，細胞体側より逆行性に伝播してくる樹状突起活動電位の寄与が大きいことが近年明らかになってきている。樹状突起における活動電位の特性は，樹状突起に存在する種々の電位依存性イオンチャネルやトランスポーターの活性により精密に調節され，さらにこれらの機能分子は細胞内のシグナル伝達系により直接・間接にコントロールされていると考えられる。この調節機構の詳細を明らかにするため，イオン・イメージングをはじめとした光学的手法と，パッチクランプ法等の電気生理学的手法を併用し，海馬スライス標本上の錐体細胞を用いて，樹状突起活動電位の解析を行っている。これまで，この活動電位の伝播とそれに伴う樹状突起内Ca²⁺の増加がGタンパクやCaMKIIを介する細胞内シグナル伝達系の活性化により促進されることを報告してきた。今年は，同様の海馬CA1領域において，活動電位の伝播を抑制する方向に働くシグナル伝達系の探索を行った。その結果，ソマトスタチン受容体を介する系が有力な候補の一つである証拠を得た。

細胞内シグナル伝達系の活性とニューロン活動との時間的・空間的関係の解析

坪川　宏，　高木　佐知子

　細胞内シグナル伝達系の活性変化は，シナプス伝達の長期増強や長期抑圧といった可塑的変化に重要な役割を果たし，また一方では細胞死を導く要因にもなりうることが知られている。ニューロン機能におけるシグナル伝達の役割をより明確にして行くために，タンパク質リン酸化酵素をはじめとした酵素群の動態と種々のニューロン活動との時間的・空間的関係を詳細に解析することは必要不可欠と考えられる。本研究は，中枢ニューロンの一つのモデルとして海馬スライス標本上の錐体細胞を用い，3量体Gタンパク質G_q及びG₁₁のカスケードにつながるタンパク質リン酸化酵素，PKCの活性変化を可視化し，ニューロン活動やそれに伴う細胞内Ca²⁺濃度変化とPKCの活性変化との時間・空間的関係を明らかにすることを目指している。今年は，ニューロン活動に伴うPKCの細胞内移動をPKC結合性蛍光色素により検出し，その時間経過や移動パターンを定量的に解析した。

中枢ニューロンの容積調節と興奮性調節の機能的カップリングの解析

高木　佐知子，　坪川　宏

　脳細胞では，てんかん発作，虚血侵襲の急性期などにswelling，blebなどと呼ばれる細胞膨張が見られる。また，海馬CA1野における遅発性細胞死やアポートシスの過程では持続的な容積減少（shrink）が観察される。しかしながら，これらの容積変化が神経障害の過程でどのような意味を持つのか不明である。本研究では，種々のニューロン活動の変化と容積変化との関係を解析し，興奮性調節と容積調節の両メカニズムに関与する分子の機能連関を明らかにすると共に，それらの破綻と病態との関連を明らかにすることを目指している。海馬など細胞が高密度に存在する脳内部位では，細胞が容積変化を起こすと，一定体積あたりの細胞と細胞間隙の占有パターンが変わり，それに応じて近赤外光の透過率が変化することが知られている。この性質を利用して，海馬スライス標本のニューロンから電気生理学的記録を行うと共に，内因性光学シグナルのイメージングを行ない，様々なストレス負荷で起こる興奮性変化と容積異常の時間的・空間的特性を解析している。今年は，シナプス活動によって海馬CA1野ニューロンに一過性の容積増加が生じること，この容積増加にはGABA性の抑制性入力が寄与していることを報告した（Takagi S, Obata K, Tsubokawa H, Soc. Neurosci Abs 27: 714, Takagi S, Obata K, Tsubokawa H, Jpn J Physiol51: S192）。

機能情報解析室

【概要】
　脳の高次機能を司る神経機構の研究が進められた。随意運動や思考に関連する脳活動を，サルとヒトを検査対象にして，大脳皮質電位の直接記録・PET（陽電子断層撮影法）・脳磁図・脳波等を併用して解析している。

意欲に関係する脳活動の研究

逵本　徹

　「意欲」の神経機序は不明な点が多い。報酬を得るために運動課題を遂行するサルの意欲は，客観的には測定不可能であるが，様々な要因で変動することが推察される。例えば課題を継続して行うと，報酬を獲得していくのに伴って，課題遂行への意欲は減退していくと考えられる。また，報酬がより望ましいものに変更されれば，意欲は増加するであろう。認知運動課題遂行中のサルの前頭前野・海馬・前帯状野の脳血流量が，想定される意欲の変化と一致した変動を示すことが陽電子断層撮影法（PET）を用いた実験で明らかになった。大脳辺縁系と前頭前野の「意欲」への関与を示唆する知見と考えられる。この脳活動の詳細を調べるため，大脳皮質フィールド電位記録法とPETによる解析を進めている。

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