16.シナプス形成・維持のダイナミクスと分子機序

2001年12月5日−12月6日
代表・世話人：尾藤晴彦（京都大学大学院医学研究科）
所内対応者：小幡邦彦（生理学研究所）

（1）

2光子励起顕微鏡を用いたグルタミン酸受容体の機能的マッピング

松崎政紀（生理学研究所）

（2）

海馬シナプスにおけるNMDA受容体のサブユニット構成

伊藤　功（九州大学大学院理学研究院）

（3）

神経細胞膜における1分子イメージング：軸索イニシャルセグメント膜の拡散障壁の形成機構

中田千枝子（名古屋大学大学院理学研究科）

（4）

SDS-FRL法によるシナプス膜蛋白の可視化と定量的解析

馬杉美和子（生理学研究所）

（5）

Songbirdキンカチョウ中枢神経系の分子マッピング

和多和宏（東京医科歯科大学難治疾患研究所）

（6）

光量子を介した標的遺伝子の時空間特異的発現制御と機能解析

安藤秀樹（理化学研究所脳科学総合研究センター）

【参加者名】
尾藤晴彦（京都大学大学院医学研究科），伊藤　功（九州大学大学院理学研究院），岡部繁男，萩原正敏，黒柳秀人，栗生俊彦，壱岐純子（東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科），和多和宏（東京医科歯科大学難治疾患研究所），安藤秀樹，岡本　仁，原野淳子，田中めぐみ（理化学研究所脳科学総合センター），武内恒成，中田千枝子，渡辺紀信（名古屋大学大学院理学研究科），白尾智明，伊藤　真（群馬大学医学部），山本亘彦，小田洋一，中山貴美子，白木千津子，小橋常彦，上阪直史，山崎信介，大波壮一郎（大阪大学大学院基礎工学研究科），玉巻伸章（京都大学大学院医学研究科），狩野方伸（金沢大学大学院医学研究科），丸山　敬，斎藤祐見子，川村勇樹，手塚満恵，李　月（埼玉医科大学），竹居光太郎（東邦大学医学部），冨樫和也（三重大学医学部），神谷温之，志牟田美佐（神戸大学大学院医学研究科），山田麻紀，池谷裕二，小山裕太（東京大学大学院薬学研究科），渡部文子，鈴木えみ子（東京大学医科学研究所），中嶋隆浩（東京大学大学院理学研究科），清末和之（産業技術総合研究所），五嶋良郎（横浜市立大学医学部），鈴木　香，大塩立華（名古屋大学医学部），小泉美佳（杏林大学医学部），講内　毅，鈴木大祐（浜松ホトニクス）北川純一（オリンパス光学），古川智洋，渡辺裕一，井田和徳（オリンパスプロマーケティング），我謝徳一（ファイザー製薬中央研究所），俵田真紀（KAN研究所），惣谷和広，森島美絵子，小原圭吾（大阪大学医学部），柳原　大（豊橋技術科学大学），河西春郎，高橋倫子，根本知巳，岸本拓哉，松崎政紀，重本隆一，籾山明子，馬杉美和子，深沢有吾，Wu Yue，岡村康司，高木佐知子，小幡邦彦，柳川右千夫，山肩葉子，兼子幸一，季　鳳雲，山中　創，常川直子，海老原利枝（生理学研究所）

【概要】

　脳神経系の機能は，神経回路が構築され，神経細胞間で情報の交換を絶えず繰り返すことにより成立する。近年の研究努力により，神経細胞は分裂停止後，予定された領域へ移動し，軸索ならびに樹状突起の伸展・成熟を経て，機能的なシナプスを形成し始め，やがて神経回路網が出来上がることが理解されるようになってきた。また，いったん形成されたシナプスも，神経活動により絶えず修飾されながら維持されていることが明らかになっている。一方において，個々のステップは，多彩な情報伝達分子群が，神経細胞内の多数のローカスで同時並行的に引き起こす複数のカスケードにより制御されていることも徐々に理解されてきた。したがって，この一連の分子機構を詳細に検討するためには，分子生物学，生化学，生理学，解剖学，細胞生物学，遺伝学，システム脳科学など異なる分野の人材の協同によるmultidisciplinaryなアプローチとその統合が必要となっている。本研究会では，「シナプス形成・維持のダイナミクスと分子機序」というテーマに焦点を絞り，広く多分野の研究者を集め，情報交換と交流を図ることを目的とする。すなわち，「シナプスグルタミン酸受容体の最前線」，「神経細胞における膜分子の動態可視化」，「モデル動物における神経回路網形成」の3つの課題において研究発表および討論をする。その討議のプロセスにより，解決可能な新規の問題点を洗い出し，今後のcross-disciplinaryな研究のシーズを見いだすことを目指す。

（1）2光子励起顕微鏡を用いたグルタミン酸受容体の機能的マッピング

松崎政紀，河西春郎（生理学研究所生体膜部門）

　樹状突起スパインは，中枢神経細胞における興奮性シナプス結合の主たる入力部位である。我々は，2光子吸収断面積が大きく，水溶液中で安定な新規のケイジドグルタミン酸を開発し，2光子励起法を用いグルタメイトの反応を単一スパインレベルで測定するシステムを構築した。これを用い，ラット海馬のスライス標本にて，ホールセルクランプしたCA1錐体細胞の樹状突起に沿って3次元的にグルタミン酸感受性マッピングを行った。グルタミン酸感受性はスパインの体積に強く相関し（相関係数0.80±0.07，9細胞），キノコ型の大きな頭部を持つスパインでは強く，細いスパインや細長いフィロポディアでは反応がないか，弱い反応しか得られなかった。この結果はいわゆる「サイレントシナプス」が後者の形態をもったスパインである可能性を示唆している。キノコ型スパインにおいて非定常ノイズ解析を行うと，AMPARの数は単一スパインあたり最大で約150個（46-147個，n = 8）存在することが判明した。一方，グルタミン酸感受性及び形態（体積）の空間的な自己相関を求めると，距離にして1μｍ以下の隣接したスパイン間においても両者共に相関が無かった。これらの結果は，スパインの形態と機能的AMPARの発現は強く相関しており，その機能的発現量は高いダイナミックレンジ（7bits）を持ちながら，単一スパインレベルで独立に調節されていることを示している。

（2）海馬シナプスにおけるNMDA受容体のサブユニット構成

伊藤　功（九州大学大学院理学研究院）

　最近我々は，海馬交連を脳の正中において切断したマウス（Ventral Hippocampal Commissure Transected mouse; VHCTマウス）から数日後に海馬スライスを作成することにより，反対側海馬からの交連線維(Commissural fiber; Com)を含まない海馬スライスを得る方法を開発した。VHCTマウスから調整した海馬スライスにおいては，シャファー側副枝(Sch)を選択的に刺激することが可能で，Sch-CA1錐体細胞シナプスのNMDA 受容体応答に対するNR2Aサブユニットのノックアウト効果，およびNR2Bサブユニット選択的阻害剤による抑制効果，等を左右の海馬で比較解析した。その結果，Sch-CA1シナプスにはNR2A/NR2Bサブユニットの構成比において異なる2種類のNMDA 受容体が左右非対称に存在していると考えられる結果を得た。また，通常のマウスとVHCTマウスを比較することにより，Com-CA1シナプスのNMDA受容体は，サブユニット構成においてSch-CA1シナプスとは逆の左右非対称性を持つことが推定された。
　脳の高次機能におけるLateralityの存在が知られているが，それを生み出す分子機構に関しては全く明らかになっていない。我々の結果が，Lateralityの形成とその発達の分子機構に関して，重要な手がかりとなることを期待したい。

（3）神経細胞膜における1分子イメージング：軸索イニシャルセグメント膜の拡散障壁の形成機構

中田千枝子（名古屋大学大学院理学研究科生命理学専攻）

　神経細胞の，細胞体/樹状突起と軸索という領域における機能的な分化は，極性のある形態や分子の局在によって保たれている。細胞膜において分子の局在を維持するためには，軸索起始部（軸索の最も細胞体側，イニシャルセグメント，IS）の細胞膜に，細胞膜分子が拡散によって混合するのを妨げる仕組みが必要なはずである。このような拡散障壁の存在と作動機構を検討するため，我々は培養海馬細胞を用い，不飽和リン脂質 (DOPE) の運動を，1分子レベルで調べた。この結果，拡散障壁は(1)脂質に対しても機能し，(2) ISの細胞膜に発達段階依存的に，形成されることがわかった。また，拡散障壁の形成は，膜骨格分子（アンキリンG）と膜骨格結合型の膜タンパク質（電位依存性Na⁺チャネル）のIS膜での密度増加と並行しておこることがわかった。これは，我々が拡散の遅延の機構として提案しているanchored-protein picket modelを考慮すると，ISの膜骨格上に，発達に伴い膜タンパク質群が密に集積することにより，細胞膜内に拡散障壁が築かれることを示唆する。また，diI（C12, C16）の挙動については，diIは拡散障壁に影響されず，極めて速い拡散を示すことがわかった。これはdiIが細胞膜内と膜／水溶液の境界間に分配しながら拡散することを示唆する。

（4）SDS-FRL法によるシナプス膜蛋白の可視化と定量的解析

馬杉美和子^{1, 2}，藤本　和^{2, 3}，足澤悦子^{1, 2}，重本隆一^{1, 2}
（¹生理学研究所・脳形態解析　²CREST³福井県立大学・生体機能構造学）

　シナプス受容体とシナプスの位置関係の解析には，連続超薄切片で膜表面を再構築する必要がある。SDS-Freeze Fracture Replica Labeling (SDS-FRL)法は，膜上分子がReplicaに固定された状態でSDS変性を受けるので，immunoblotとほぼ同じ抗原抗体反応が起こることが予想され，適応できる抗体が多く応用範囲が広い。
　抗GluRd2抗体を用いてラット小脳のSDS-FRLを行うと，膜内粒子の凝集と一致してGluRd2のラベリングが観察された。Adult ratではPurkinje細胞の膜内粒子の凝集のうち，特に大型のものに一致してGluR1-4のラベリングが見られた。しかし，postnatal day3ラットのPurkinje細胞シナプスでは，ラベリングはやはり膜内粒子の凝集と一致するものの，非常に均一でありAdultで見られたようなcompartmentalizationは認められない。さらに，免疫系でラフトのマーカーであるコレラトキシンを用いたGM1のラベリングは，主にE面に多いが，顆粒細胞においてはE面だけでなくP面にも強い発現が観察された。
　このようにSDS-FRL法は膜上分子の分布状態を二次元的に可視化でき，固定の難しさから今までアプローチが難しかった脂質についても高解像度の観察が出来，また非常に高率で定量性のあるラベリングが可能である。

（5）Songbirdsキンカチョウ中枢神経系の分子マッピング

和多和宏（東京医科歯科大学難治疾患研究所形質発現分野）
坂口博信（獨協医科大学医学部生理）
Erich D Jarvis (Duke University Department of Neurobiology）
萩原正敏 (東京医科歯科大学難治疾患研究所形質発現分野)

　動物行動学の知見から，vocal learningは3種のほ乳類；ヒト，クジラ／イルカ，コウモリと3種の鳥類；songbird鳴禽類，hummingbirdハチドリ，parrotオウムにのみ認められる学習であると考えられる。鳥類とヒトの言語学習におけるvocal learningには多くの共通点が存在する。1）学習臨界期を有する。2）他個体からの音声鋳型の提示を必要とする。3）正確な発声のために聴覚feedbackが重要である。4）社会的環境による影響を受ける。
　解剖学的，電気生理学的にsongbirdsにおいては「song system」と呼ばれるvocallearning, productionに関わる神経回路が明らかにされてきた。しかしこれを支える分子基盤については不明である。そこで我々は，ヒトのvocal（言語）learning理解のため，songbirdsのsong systemを比較神経回路モデルとして用い，分子レベルでの神経回路基盤を探究できるのではないかと考えた。songbirds brainからクローニングした19のglutamate receptor subunit (NMDA, AMPA, KA, metabotropic types) は，song systemを構成する種々の細胞群において各々 特異的な発現パターンを示した。さらに今後の展望も含め，併せて発表させていただきたい。

（6）光量子を介した標的遺伝子の時空間特異的発現制御と機能解析

安藤秀樹（理化学研究所脳科学総合研究センター発生遺伝子制御研究チーム）

　我々はゼブラフィッシュ胚で光量子エネルギーを介した時空間特異的な遺伝子発現誘導法を紹介する。本法は新しく，また簡便な技術で標的遺伝子のコンデイショナルな発現を可能にした。新規合成ケージド化合物6-bromo-4-diazomethyl-7-hydroxycoumarin (Bhc-diazo)はRNA やDNAの糖−リン酸基骨格のリン酸基にケージングとよばれるプロセスを経て結合する。Bhc-diazoはRNA 1kbあたり約30箇所のリン酸基に結合し翻訳を阻害する。結合したBhcは瞬間的な紫外線(350-365nm)照射により効率的に解離し（アンケージング）翻訳可能なメッセンジャーRNAに戻す。in vitro翻訳活性を調べた結果，ケージドGFPmRNAは著しく翻訳活性を阻害されていたが，紫外線照射されたアンケージドRNAは部分的に翻訳を再開した。またケージドRNAは胚内で安定に維持されていた。ケージドmRNAを1細胞期に注入された胚では，発生のある時期に紫外線照射部位に特異的に標的遺伝子が発現していた。また，転写因子Engrailed2aのmRNAを本法により頭部のみに過剰発現させた胚では眼の欠失と終脳・間脳の顕著な形成阻害および中脳の形成促進が顕著であった。このことはEngrailed2aが従来知られていた間脳形成のみならず終脳形成をも抑制することを示した初めての例である。

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