生理学研究所年報2002

17.生体分子ダイナミクス及びプリオン機構

2002年2月6日－2月8日
代表・世話人：桑田一夫（岐阜大学医学部生理学）
所内対応者：永山國昭（統合バイオサイエンスセンター）

（１）: 異常型プリオン蛋白質特異的抗体は作製可能か？

堀内　基広（帯広畜産大学原虫病研究センター）
（２）: プリオン病－新しいプレイヤーの同定の試みと治療法開発に向けて－

金子　清俊（国立精神・神経センター神経研究所）
（３）: プリオン病の構造生物学と創薬

桑田　一夫（岐阜大学医学部生理学）
（４）: アミロイド凝集，不定形凝集，及びクロスリンク凝集

今野　卓（福井医科大学・生理学）
（５）: アミロイド線維伸長反応のマクロ及びミクロスコピックな解析

浜田　大三（大阪大学・蛋白質研究所）
（６）: 高圧NMRによる蛋白質の新しいダイナミックス像

赤坂　一之（立命館大学理工学部理研播磨研究所）
（７）: バイオナノテクノロジー

猪飼　篤（東京工業大学生命理工学研究科）
（８）: 相転移を利用したDNA－分子の操作

水野　彰（豊橋技術科学大学）
（９）: 情報伝達蛋白質の細胞内ダイナミクス

佐甲　靖志（大阪大学大学院医学系研究科）
（10）: シャペロニン機能と，mRNAの核内運動の1分子蛍光イメージング

船津　高志（早稲田大学理工学部）
（11）: セミインタクト細胞系とGFP可視化技術を用いた細胞内オルガネラダイナミクスの研究

村田　昌之（統合バイオサイエンスセンター）
（12）: 蛋白質の遅い構造ゆらぎ

石井　由晴（科学技術振興事業団1分子過程プロジェクト）
（13）: 天然構造長時間ダイナミクス再現に向けた計算機実験

高野　光則（東京大学総合文化研究科）
（14）: 蛋白質フォールディングのダイナミックス異常拡散と階層的規則性

松永　康佑，小松　民樹（神戸大学理学部）
（15）: Energy landscape of a peptide, cut from a distal β-hairpin of SH3 domain, including random-coil, b-hairpin, and α-helix, and pathways among the conformations

Kazuyoshi Ikeda and Junichi Higo（東京薬科学）
（16）: 水の揺らぎと反応；水は如何に凍るか，反応の方向性と揺らぎを如何に観測できるか？

大峯　巌（名古屋大学）
（17）: タンパク質のダイナミクス・データベースの構築

輪湖　博（早稲田大学社会科学部）
猿渡　茂（北里大学理学部）
（18）: 複雑系としての生命論理

金子　邦彦（東京大学・総合文科研究科）
（19）: Electrostatic free energy calculation of solvent ion transfer from outside to inside cavity of wild type and mutant horse L ferritin

Takuya Takahashi（計算科学研究センター，岡崎）
（20）: 分子ポンプの方向性を決めるもの（副題）蛋白質はやわらかいかかたいか？

神取秀樹（名古屋工業大学）
（21）: 蛋白質の振動エネルギー移動：蛋白質の非線形ダイナミクス解析への試み

木寺　詔紀（横浜市立大学大学院総合理学研究科）
（22）: 赤外領域における非線形分光法の展開

富永圭介（神戸大分子フォトサイエンス研究センター）
（23）: CO結合型ミオグロビンにおけるヘム振動エネルギー緩和

長岡　正隆（名古屋大学）
（24）: 蛋白質の時間分解エネルギー・構造変化

寺嶋　正秀（京都大学理学研究科）
（25）: ヘムタンパク質のリガンド結合部位の構造揺らぎ

水谷泰久（神戸大学分子フォトサイエンス研究センター）

【参加者名】
鎌足雄司（理研播磨），佐伯政俊（東京理科大），北原亮（神戸大），小松崎民樹（神戸大），中村寛則（名古屋大），堀内基広（帯広畜産大），北尾彰朗（原子力研），八谷如美（精神・神経研），渡辺光太（精神・神経研），逆瀬川裕二（精神・神経研），金子清俊（精神・神経研），城地保昌（横浜市大），木寺詔紀（横浜市大），濱田大三（阪大蛋白研），桑田一夫（岐阜大），森次圭（横浜市大），石井由晴（科技団・1分子プロジェクト），手島圭三（広島大），中村周吾（東京大），関嶋政和（東京大），松本友治（生理研），川上勝（神戸大），船津高志（早稲田大），水谷泰久（神戸大），占部久子（東京家政大），肥後順一（東京薬科大），池田和由（東京薬科大），山本晃司（神戸大），恵良聖一（岐阜大），赤坂一之（立命館大），中岡太之（阪大蛋白研），輪湖博（早稲田大），佐甲靖志（阪大），村田昌之（統合バイオ），加納ふみ（京都大），田中亜路（京都大），今野卓（福井医大），内田毅（分子研），長岡正隆（名古屋大院），北川禎三（分子研），高橋卓也（計算科学センター），小久保裕功（分子研），榮慶丈（分子研），池口満徳（横浜市大），太田雄大（統合バイオ），松永康佑（神戸大），猪飼篤（東京工業大），岡田興昌（富士ゼロックス（株）），松浦俊一（豊橋技科大），中野通彦（豊橋技科大），古牧卓也（豊橋技科大），神取秀樹（名工大），桂進司（豊橋技科大），永山国昭（統合バイオ），水野彰（豊橋技科大），佐々木尚（名古屋大），金子邦彦（東京大），桧山武史（基生研），古明地勇人（産総研），猿渡茂（北里大），高野光則（東京大），寺嶋正秀（京都大），Aneliya Zdravkova（統合バイオ），大峰巌（名古屋大），村田克美（分子研），冨永圭介（神戸大）

【概要】

　細胞の生理機能は，チャンネル，レセプター，細胞内情報伝達系等の蛋白質によって主に担われている。多くの蛋白質の「静的構造」はX線回折，NMR，電子顕微鏡等の技術の発展により，明らかにされつつある。しかし，「静的」な平均構造からその機能を推定出来るかどうか必ずしも明らかではない。即ち，生理機能は構造の時間的変化とカップルしており，自然な状態での蛋白質のダイナミクスを理解しなければ，その機能を真に理解することは出来ない。ここに蛋白質のダイナミクスを研究する目的がある。特に，プリオンの病原性機構は，共有結合（化学結合）構造には変化がなく，3次元立体構造のみの変化であると考えられているため，その病的機能の理解及び治療法の開発には，蛋白質ダイナミクス研究が鍵となる。
　本研究会においては「プリオン機構」（2月6日午後），「1分子計測／1細胞計測」（2月7日午前），「実験及び計算機シミュレ－ション」（2月7日午後～2月8日午後），と大きく三つのテーマに分けて研究発表がなされ，それぞれの観点から相互に活発な議論が行われた。まず，抗プリオン抗体の開発状況，プリオン病の予防・治療法開発，Virtual Ligand Screeningによるプリオン病治療薬の開発状況について最新の報告があった。さらに，アミロイド凝集のメカニズム，アミロイド凝集過程の1分子測定，更に最新の高圧NMR測定による新しい蛋白質ダイナミクス像に関する報告があり，プリオン機構の観点からも多くの議論が行われた。2日目は，原子間力顕微鏡を用いた蛋白質のナノ力学，DNA操作，1分子／1細胞測定に関する最新のデータが示され，活発な討論が行われた。2日目の午後から3日目にかけて，蛋白質の長時間ダイナミクスや遅い揺らぎに関する理論及び計算機シミュレーションの進展，多量子分光学の方法論的発展等が紹介された。全体として，「蛋白質の機能や病原性に関わるメカニズムを分子の構造や動きから詳細に解き明かし，これらを通じて新しい科学技術分野の創出，及び予防・治療法の開発を目指す」，という目的に沿い最新の研究成果発表とそれに続く活発な討論が3日間に渡って行われた。

（1）異常型プリオン蛋白質特異的抗体は作製可能か？

堀内　基広（帯広畜産大学原虫病研究センター）

　正常な動物の組織には正常型プリオン蛋白質PrP^Cが存在する。PrP^Cは特に中枢神経系組織で発現が高い。一方，プリオン病に罹患した動物の中枢神経系組織ではPrP^Cとその病原性構造異性体であるPrP^Scが共存する。PrP^Scは細胞膜上に発現した成熟型PrP^Cから構造転換を含む何らかの翻訳後修飾により産生されると考えられている。PrP^CとPrP^Scは宿主遺伝子PrPにコードされる蛋白質であることから，その一次構造は同じである。現在プリオン病の確定診断に用いられているPrP^Sc検出法は，1)被検試料から蛋白質分解酵素処理によりPrP^Cを除去，2)変性剤処理によるPrP^Sc凝集体の解離および変性，3)抗PrP抗体(pan-PrP抗体)による変性PrP^Scの検出，の3段階から構成される。PrP^Sc凝集体はpan-PrP抗体が認識するエピトープを分子表面に露出していないためにエピトープを露出させるための変性剤処理が必要であり，また，pan-PrP抗体はPrP^Cと変性PrP^Scを識別することはできないことから，PrP^C除去操作が必須である。これまでに作製された抗PrP抗体はほとんどがpan-PrP抗体の範疇に属する。PrP^CとPrP^Scは高次構造に違いがあることから，pan-PrP抗体とは異なり，PrP^Sc特異的な高次構造を認識する抗体が作製可能ではないかと考えられてきた。PrP^Sc特異的抗体は新規プリオン病診断技術の開発に応用が期待されており，また，依然未解明の部分が多いPrP^Scの性状解析にも非常に有用な道具となり得る。1997年にKorthらは大腸菌で発現した組み換え牛PrPをPrP欠損マウスに免疫して，PrP^Sc特異的抗体(mAb 15B3)が得られたことを報告し注目を集めた。しかしその後，mAb15B3を用いた研究の進展は報告されていない。我々はPrP^Sc特異的抗体の作製を目的として，スクレイピー感染マウスから高度に精製した感染性を有するPrP^Sc画分をPrP欠損マウスに免疫して，PrP^Sc特異的抗体の作製を行っている。そこで，これまでに得られた成績と，PrP^Sc特異的抗体がプリオン病の研究進展にどのように寄与するのかについて議論したい。

（2）プリオン病-新しいプレイヤーの同定の試みと治療法開発に向けて-

金子　清俊（国立精神神経センター神経研究所）

　平成13年9月11日に千葉県で日本初の牛海綿状脳症（以下BSE）に罹患した乳牛が発見され，日本中にBSEに対する懸念が広がっている。その一因は，英国における変異型CJD (variant CJD)と呼称される人のプリオン病が，BSEに由来すると考えられている事に起因する。残念ながら，vCJDを含むプリオン病は，現時点では有効な治療法がなく100％致死性の疾患であるといわざるを得ない。本会では，プリオン病の治療の開発の現状を中心にまとめさせていただく。治療法開発のストラテジーとして，我々は，（1）感染型プリオンの元となる正常型プリオンを分解する方法，（2）ドミナントネガティブ効果を有する防御型プリオン蛋白の利用，（3）抗プリオン抗体の応用，を試みている。これらのストラテジーには，プリオン蛋白分解酵素や，分子シャペロン様の機能を有する分子としてその存在が想定されているX因子の同定が密接に絡む。「プリオン」という造語が誕生して以来20年が経過したが，これらを含めたプリオン蛋白関連分子は，未だ一つも同定されていないといっても過言ではない。「もうそろそろ新しいプレイヤーが同定されなければ」との思いを抱くのは，私どもだけではないであろう。

（3）プリオン病の構造生物学と創薬

桑田　一夫（岐阜大学医学部生理学）

　正常型プリオンのNMR立体構造は，ハムスター（shPrP），マウス（mPrP），ウシ（bPrP），ヒト（hPrP）で明らかにされた。これらの立体構造は微妙な差はあるものの，グローバルなフォールドはほぼ共通している。実際これらの構造は，ほとんど重なり合う。従って，このような静的なNMR立体構造を眺めるだけで，正常から異常への変換機構や種間障壁を理解できるかどうか，今のところはっきりしない。プリオン立体構造変化に関する研究では，低pH，尿素やグアニジン塩酸等の変性剤の存在下を用いた二次構造測定が行われ，平衡状態での中間体が観測されている。我々は，高圧NMR法を用いて中間体の構造を世界で初めて残基レベルで特徴付けた。更にこのような励起状態をターゲットにしてVirtual Ligand Screeningを行い，励起構造にのみ親和性の高いLigandを探索し，プリオン病治療薬の開発を試みた。

（4）アミロイド凝集，不定形凝集，及びクロスリンク凝集

今野　卓（福井医科大学生理学）

　生体内環境における蛋白質分子は，種々タイプの分子凝集過程を容易に実現する。周知のごとく，この凝集過程が生理・病理現象を構成する基本的要素の一つであるという認識が，近年の生命科学研究の多くを積極的に動機づけている。本件では特に次の可能性に注目する。すなわち，複雑な生体溶液系では複数タイプの蛋白質凝集過程が同時進行的に誘起され，それらが互いに促進もしくは抑制等の過程間相互作用を示しうるという点である。ここでは，異種タイプの凝集過程間の相互依存に関わる物理化学的特性を一般的視点より明らかにする研究の手がかりとなる具体的ケースを，いくつか例示し，異種凝集タイプ間の相互作用を描写するスキームのプロトタイプをも，幾つか示したい。具体的内容は以下の3件に分かれる。
　1) 単一種の蛋白質が実現する複数の異なるタイプの凝集過程の例示
　2) アミロイド凝集体が不定形凝集過程を誘起する場合の例示
　3) クロスリンク凝集と不定形凝集過程の間の競合が存在する場合の例示
　ちなみに，本件で扱うような複合的な凝集現象を全てを包括する体系的視点とその生理・病理的意義を確立することが，今後の課題として想定される。

（5）アミロイド線維伸長反応のマクロ及びミクロスコピックな解析

浜田　大三（大阪大学蛋白質研究所）

　いくつかの蛋白質は，変性しアミロイド線維へと自己組織化する。アミロイド線維に関する研究は，医学のみならず，蛋白質（ナノ）工学的にも重要である。マクロ及びミクロスコピックな系において，この反応過程を速度論的に解析することは，その形成メカニズム知るための重要な知見を与える。
　アミロイド形成過程には，前駆体形成，核形成，線維伸長，線維切断などの段階があると考えられる。このような複雑なモデルを用いた場合，質・量ともに限られたマクロ条件下で得たデータを，正確に解析することは不可能に近い。
　アミロイド形成反応をチオフラビンTなどで観察した場合，その変化は，シグモイド曲線で描かれる。これは拡張指数型関数(y = y_∞ + Δy exp(- (k_spt)^γ): γ＞1) により，近似することができる。
　ウシ・βラクトグロブリンの尿素存在下における線維形成について，上記の式を用いて解析した結果，以下のことが明らかになった。
　1）自発的及び，核存在下での伸長速度は，尿素変性の中点で最も速い。
　2）線維に取り込まれる蛋白質の量は，みかけの伸長速度定数k_spに比例する。
　3）天然状態の安定化により，線維形成が抑制される。
　また，ミクロスコピックな解析の取り組みとして，エヴァネッセント場一分子蛍光顕微鏡による，線維伸長反応の観察結果を行った。この実験により，個々の線維はそれぞれに固有の速さで伸長することが，示唆された。

（6）高圧NMRによる蛋白質の新しいダイナミックス像

赤坂　一之（立命館大学理工学部理研播磨研究所）

　生理条件下での蛋白質は，本来，多重構造をもっている。それらは，互いにわずかな自由エネルギー差ながら，一方的なポピュレーション差をつくり出すには十分であるため，“非”天然の構造は，常に“天然構造”の後ろに隠れたままでいる。様々な蛋白質の基底状態構造を蛋白質構造の“横軸”とすれば，それぞれの蛋白質の自由エネルギーの異なる構造は，その“縦軸”である。しかし，細胞内の蛋白質は，常に全構造空間を渡り歩いており，むしろ基底状態である天然構造以外のところから必要な反応が起こる可能性がある。
　これまで，蛋白質の構造を，この縦軸に沿って解析する一般的な実験方法がなく，われわれの基底構造以外の蛋白質構造についての知識は限られているばかりでなく，蛋白質の概念そのものが，非常に間違ったものとなっているかも知れない。自由エネルギーの異なる蛋白質の様々な構造を分離観測するのに適した方法は，それらの間の体積差を利用するオンラインセル方式の高圧NMR法である。圧力を変えることにより，体積軸で多様な構造を分け，できればそれぞれに対して二次元（多次元）NMRの高い空間分解能による構造解析を行う点が特徴である。
　これらの実験は，広い構造空間で揺れ動く，新しいダイナミックな蛋白質像を与えてくれる。

(7)バイオナノテクノロジー

猪飼　篤（東京工業大学生命理工学研究科）

　タンパク質やDNAの単一分子に触って動かす技術が開発されて以来，バイオナノテクノロジーに対する期待が高まっている。DNAを操作することはとりもなおさず生命機能の変換を正確な機械的操作で行うことが可能となることを告げている。DNA操作により機能を変換された細胞はその後の分裂を通じて新しい機能をもつ子孫を無限に殖やして行くことができる。タンパク質の場合はその力学特性の測定により将来の分子ナノマシン設計への展望を開いてくれる。バネ仕掛け，時計仕掛けの分子機械が人間の体内で動作するという夢のような話が数十年後には実現する可能性がある。これがバイオナノテクノロジーの一面である。一方，細胞に目を向けるとこれも単一細胞レベルでの疾病診断やタンパク質の機能解析のために，単一細胞の各部位から高い時間分解を持つ方法によりmRNAやタンパク質の発現状況を調べるシングルセルプロテオミクス法が開発されつつ現状を報告する。

（8）相転移を利用したDNA―分子の操作

水野　彰（豊橋技術科学大学）

　ポストゲノムの時代を迎え，遺伝情報による新薬の開発や，個人の遺伝情報を病気診断や予防に使うことが一層進むものと考えられる。このためには今まで以上に高速の解析手段の実用化が期待されている。また，たんぱく質との相互作用の解析を進めることで，生命活動の解明も一層進展するものと期待される。特にDNA分子に対して，1分子の操作とサブミクロン領域に化学反応場を局在化する制御が可能となれば，ゲノムDNA塩基配列の高速度解析技術，1分子レベルでの転写・複製反応の動態解析などの分野で新しいアプリケーションが拓けることが期待できる。また，一分子あるいは極微量のサンプルを用い，微小反応装置で解析を行うことは，反応速度の向上につながる。これは，反応は拡散速度で規定されるため，微小反応装置ではきわめて早く分子同士の会合が起こるためである。
　筆者らのグループでは，染色体DNA1分子を，グロビュール化相転移を用いて損傷なく輸送し，逆の相転移を用いて基板上に直線状に伸長させるなど，形態や位置を制御する技術開発を静電気力とレーザートラッピングを用いて進めている。また，伸張固定したDNA1分子に蛍光色素ラベルした制限酵素を結合させ制限酵素地図を作成すること，レーザーなどを用いて局所的に切断し，断片を回収しPCR増幅するなどの，1分子を対象とする加工および反応操作技術の開発を行っている。油中に直径10ミクロン程度の液滴を作り，この液滴にDNA分子の断片やPCRに必要な酵素などを入れることで，極めて小さい反応体積で化学反応を行う系を作成し，未知配列のDNA切断断片をPCRにより増幅できることを確認した。これらの1分子を対象とした操作法ならびに分子加工・反応操作について紹介をさせていただく。

（9）情報伝達蛋白質の細胞内ダイナミクス

佐甲　靖志（大阪大学大学院医学系研究科）

　我々は，従来の全反射型の近接場蛍光顕微鏡を用いた水溶液中での蛍光1分子観察法を発展させ，生きている細胞で，細胞膜分子を1分子可視化する方法を開発した。1分子計測では，分子の振る舞いを，集団の時間・空間平均に邪魔されることなく，ひとつひとつ測定できるため，測定結果の解釈はより確実であり，分子機構が考え易くなるなどの利点がある。
　我々はこの方法で，細胞増殖信号を受容する細胞膜の上皮成長因子(EGF)受容体と，その下流で働く情報蛋白質分子Rasの細胞内挙動を1分子計測した。EGFに対する応答は，細胞当たり100分子程度の反応で開始される。EGF受容体は細胞膜上でクラスターを作っており，これが情報伝達反応の開始点として働いている。一方で受容体分子は熱ゆらぎで細胞膜上を拡散運動している。EGFの結合によって少数の受容体分子が活性化されると，分子はこの組織化と運動性を利用してEGFの結合していない受容体を活性化していくことができ，EGF分子の情報は増幅される。Rasとその効果器であるRaf1分子との認識反応も動的であり，しかも，細胞内で局所に限定して起こる。局所に集合した活性化分子は，膜上あるいは細胞質と膜の間でたえず入れ替わっている。このように，情報分子の反応はダイナミックであり，しかも細胞内で時間的・空間的に制御されている。

（10）シャペロニン機能と，mRNAの核内運動の1分子蛍光イメージング

船津　高志（早稲田大学理工学部）

　ゲノムの塩基配列が決められ，次の目標として残ったのは，実際に発現している遺伝子は何か。その遺伝子産物（主にタンパク質）は，何時どの細胞でどのように発現しているのか。そして機能は何かという問題である。1分子蛍光イメージング法は，これらの問題を明らかにするための基盤技術を提供すると期待されている。本講演では，1分子蛍光イメージング法によるin vitroの研究例として，タンパク質分子間相互作用（シャペロニンによるタンパク質の折り畳み）のイメージングを紹介し，in vivoの研究例として，生きた細胞の核内でmRNAがどのように運動しているかを解析した例を紹介する。さらに，1分子蛍光イメージング法が，どのようにポストゲノム研究に展開するかを展望する。

（11）セミインタクト細胞系とGFP可視化技術を用いた細胞内オルガネラダイナミクスの研究

村田　昌之（統合バイオサイエンスセンター）

　われわれは，細胞の極性及びオルガネラの形態形成とその維持機構を，細胞内小胞輸送ネットワークを介するタンパク質・脂質の細胞内ターゲティングの分子メカニズム研究として捉え，その制御機構の解明を目指している。本シンポジウムでは，特に哺乳動物細胞のゴルジ体及び小胞体（ER）ネットワークの細胞周期依存的な形態変化と両オルガネラ間の小胞輸送過程のダイナミクスとのカップリングの分子メカニズムについてのわれわれの最近の知見を紹介する。われわれは，先ず，ゴルジ体及びERに局在化するタンパク質（ガラクトシルトランスフェラーゼ及びHSP47）のGFP融合タンパク質を用い，それぞれのオルガネラを可視化した。次に，細胞膜を部分的に透過性にしたセミインタクト細胞系とGFP可視化技術をカップルさせた顕微アッセイシステムを用い，間期及びＭ期のゴルジ体・ERそれぞれの形態変化，ER⇔ゴルジ体間輸送過程を顕微鏡下の単一のセミインタクト培養細胞内で再構成し，形態変化や輸送過程に必要な因子の生化学的な解析と輸送キネティックスの定量的解析を行った。その結果，Ｍ期にはcdc2 キナーゼによって制御されるゴルジ体の崩壊，ERネットとワークの部分的切断，ERからゴルジ体への順行輸送過程の選択的停止などが協奏的に起こり，細胞分裂時のオルガネラの娘細胞への均等分配が旨く説明できることを明らかにした。

（12）蛋白質の遅い構造ゆらぎ

石井　由晴（科学技術振興事業団1分子過程プロジェクト）

　タンパク質はアミノ酸配列が決まれば，その挙動は唯一に決まるものと考えられてきた。例えば3次元構造は一つに決まり，その構造をとるフォールディングの仕方も一つに決まっているものと，想像していた。またタンパク質の機能は，そのユニークな構造が変化することにより，機械論的に決まると考えられてきた。しかしタンパク質がナノメートルの大きさを持ち，周囲の水分子から常に熱運動の揺らぎにさらされていることや，熱エネルギーと大差ない入力エネルギーを使って機能していることを考えると，これまでのタンパク質像を見直して見る必要がある。事実，タンパク質の多重構造や機能の多様性が示唆され，その分子機構に興味が持たれている。
　タンパク質の多重構造や動的な構造変化を計測するには，従来の非常に多数の分子の集合からの平均値の計測では，平均値に隠れて計測できない。そこで1分子からの信号を直接計測することにより蛋白質分子の動的挙動を観察した。蛋白質1分子の動的構造変化は，蛋白質の特定の部位に蛍光色素を導入し，その蛍光スペクトルの変化や，蛍光エネルギー移動効率の変化を計測した。
　その結果，1分子の構造を直接モニターすることにより，タンパク質には同時に複数個の形態をとりうること，そしてそれら異なった形態の間を，秒あるいはサブ秒というゆっくりした時間オーダーで転移しうることが示された。これはタンパク質が局所平衡に対応するいくつかの準安定な状態を取って，その間のエネルギー障壁を越えて転移していることを反映しているものと思われる。このようなタンパク質の動的な挙動は，機能を考えるときに非常に重要であるように思われる。機能の観察と動的構造変化を結びつけながら計測することが重要であり，1分子計測で直接そのカップリングを決定することを目指している。

（13）天然構造長時間ダイナミクス再現に向けた計算機実験

高野　光則（東京大学総合文化研究科）

　蛋白質分子の天然構造近傍の構造変化ダイナミクスが分子機能を説明するのに必須である系は多い。構造変化ダイナミクス・分子機能の詳細に探りを入れるのに計算機実験は有効な手段の一つである。しかし，全原子モデルと呼ばれる高精度モデルではマイクロ秒の計算が限界で，ミリ秒オーダーの現象を扱うことは難しい。
　高精度全原子モデルの代わりに時空間精度を落とした粗視化モデルを用いることは一つの有望な策である。むろん忠実性という点では粗視化は不利だが，カバーできる時間空間スケール拡大のメリットは大きい。重要なのは，粗視化で何が失われ何が保存されるかである。本研究では，BPTI，RNaseT1等の小型蛋白質について，全原子モデルと粗視化モデルそれぞれで計算機実験を行い，観測される分子運動様式の比較を行った。主成分解析によって特徴づけられた運動様式を比較すると，大きな揺らぎを示す主成分軸の「方向」に関して，全原子モデルと粗視化モデルとの間に高い類似性が見出されることが分かった。このことは，天然構造ダイナミクスの重要な指標の一つである協調的分子運動の方向性が，モデルの詳細に依存しないロバストな物性であることを示しており，同時に，それが分子形状でほぼ決まっていることを示唆している。

（14）蛋白質フォールディングのダイナミックス異常拡散と階層的規則性

松永　康佑，小松崎　民樹（神戸大学理学部）

　蛋白質の折れ畳みの「ダイナミックス」において発見された異常拡散は，効率良く折れ畳む，蛋白質の折れ畳みダイナミックスは進化過程で獲得されたファネル型エネルギー地形上を単なる“確率過程”として緩和する描像では捉えきれないことを提言している。本講演では，“ランダム”な時系列から規則構造を取り出す埋め込み論，有限サイズリヤプノフ解析などの手法を用いて，Thirumalai らの46バネービーズモデルなどの折れ畳みシミュレーション（Berendsenによる等温MD）で得られる時系列を解析する。ここでは，主成分解析と埋め込み論を併用し，揺らぎの大きい10数自由度の埋め込み次元（運動がランダムであればあるほど，系を構成する全自由度の総数に漸近する）が相対的に低く，かつ転移温度では他の温度領域のそれに比べて顕著に小さく，転移温度領域のダイナミックスは力学的な規則性を保有する傾向にあることを示し，それがGarcíaと Hummerによる酸化チトクロームcの水溶液中の蛋白質ダイナミックスの異常拡散に対する理論的解釈を与えることに相当することを紹介する。

（15）Energy landscape of a peptide, cut from a distal β-hairpin of SH3 domain, including random-coil,β-hairpin, and α-helix, and pathways among the conformations

Kazuyoshi Ikeda and Junichi Higo（東京薬科大学）

　We studied the energy landscape of a peptide [Ace-Ala- His-Ser-Leu-Thr-Thr-Gly-Gln-Thr-Nme] with multicanonical MD simulation. This peptide sequence was derived from the 45’th to 53’th residues of the src SH3 domain. The conformation of the sequence in the SH3 domain is a β-hairpin. The peptide was confined to a water sphere.
　The obtained energy landscape was separated into some clusters of well-structured conformations as well as random ones. The probabilities of existence for each conformation at 300 K were 8% for the β-hairpin, 18% for the α-helix, and 68% for the random-coil. The current work showed that the peptide has a potential tendency to a-helix conformations, although it takes the β-hairpin in the whole protein. In this study, the pathways for the structural changes among those conformations were discussed. And a possible pathway for the whole protein folding of the SH3 domain was also proposed with investigating the energy landscape.

（16）水の揺らぎと反応；水は如何に凍るか，反応の方向性と揺らぎを如何に観測できるか？

大峯　巌（名古屋大学）

　我々は，6年間かけ世界で初めてシミュレーションによる純水の結晶化に成功した。非常に長時間のシミュレーションを行い，長い導入時間の後，結晶核が急速に生じることを見つけた。初期核の生成機構や，氷化にかかわる大域的ポテンシャルエネルギー面が漏斗型をしていることなどを見つけた。また水の氷化に対するポテンシャルエネルギー面の大域的性質が局所的に漏斗型（Local Funnel Structure）をしていることを見つけた。始めの過冷却の状態，いわゆる氷化の導入部では，長寿命の水素結合の生成消滅が時々刻々繰り返されており，ある時間帯にはそれが大きく成長するが空間的に散った状態であり，すぐに消滅してしまう。この様な時間帯は間欠的に現れる。この間欠性はいわゆるフラストレート・システムの特徴である。この様な導入部が続いた後，ある瞬間にいくつかの長寿命の水素結合が局所的に集合し初期核を形成する。その初期核は水素結合を交代させながら場所を移動し，その直後から急速に結晶的構造化が進む。この過程はいわゆる「単純な核成長過程」ではなく，ここでも水の構造変化の基本である集団性が現れる。

（17）タンパク質のダイナミクス・データベースの構築

輪湖　博（早稲田大学社会科学部）
猿渡　茂（北里大学理学部）

　タンパク質のダイナミクスに関する計算手法には，基準振動解析，分子動力学，モンテカルロ・シミュレーションなどがある。分子動力学やモンテカルロ・シミュレーションは，基準振動解析に比べ，より大きなゆらぎを取り扱うことができるが，その分長時間の計算が必要である。したがって，データベースを作ることを目的として，さまざまなタンパク質について網羅的に計算を行うことは，現時点では実現性に乏しいと言わざるを得ない。一方基準振動解析も，エネルギー極小化の過程で長時間の計算を必要とするが，分子動力学やモンテカルロ・シミュレーションに比較すれば，相当数のタンパク質について計算を実行し，データベースに結果を蓄積することが可能と思われる。データベースとしての利用価値の一つは，量が質を凌駕する，というように，多くのデータが収集されることによって初めて得られる創発的な知見への期待であり，分子動力学やモンテカルロ・シミュレーションに比べ基準振動解析の近似の程度は悪いという欠点があるにしても，相当数のタンパク質について計算が実行できることの意義は大きいであろう。こうしたことを踏まえ，PDBに登録されたタンパク質について基準振動解析を行い，その結果を順次データベースとして公開していきたいと思っている。

（18）複雑系としての生命論理

金子　邦彦（東京大学総合文科研究科）

　生命システムを内部のダイナミクスと相互作用が拮抗する増殖系の示す普遍的現象として捉え，発生過程，進化を議論する。理想化した細胞系として，内部での化学反応，細胞間相互作用，そして分裂からなる力学系を考える。その系の普遍的な性質として，多様な細胞のもととなる「幹細胞」から決まったタイプしか作れない細胞へと至る細胞分化過程があらわれる。この結果をふまえ，発生過程の安定性と不可逆性を熱力学と対比して議論する。ついで，この力学系的分化の考えを進化に適用し，相互作用による表現型の分化が遺伝型へ固定されるという，種分化の考えを提示する。最後に，このような複雑系生命科学の立場での細胞生物学の実験について触れる。

（19）Electrostatic free energy calculation of solvent ion transfer from outside to inside cavity of wild type and mutant horse L ferritin

Takuya Takahashi（計算科学研究センター，岡崎）

　A ferritin is an iron storage protein that has an 80 Å diameter cavity inside and is composed of 24 subunits which assembled with cubic symmetry. The electrostatic free energy changes of transferring divalent and monovalent cations from outside to cavity in wild type and mutant horse L ferritin molecules were calculated at neutral pH region by solving the Poisson equation in the channel region and the Poisson-Boltzman equation in solvent region with finite difference method. The molecule has two types of channels connecting outside and inside. One is hydrophobic channel at the 4-fold axis and the other is hydrophilic channel at the 3-fold axis. First, the calculated electrostatic potential inside the cavity of the wild type molecule showed the negative net charge. In case of the 4-fold channels, large potential barriers mainly due to self energy were found for both cations and anions. So, it was almost negligible for ions to pass through the hydrophobic 4-fold channel, especially for divalent cations such as Fe, Cd and Ca that have large self energy, ~50 kT. On the other hand, the 3-fold channels have cation binding sites where one deep energy well for single ion transfer, ~-30 kT, was found near the Glu134 and Asp131 50 Åfar from the molecular center. Then, multi ion transfer profile was calculated. Both the divalent and monovalent cations can pass through the 3-fold channel with only a few kT barrier. In addition to this finding the experimentally obtained positions of three Cd²⁺ binding sites in the 3-fold channel was well reproduced. Second, the electrostatic potential of the mutant ferritin, which have no cation binding sites (i.e., Glu134 and Asp131) at the 3-fold channel and several inside Glu residues were changed to Lys, was calculated.The potential inside the cavity was positive and transfer of divalent cation was quite unfavorable for both the channels. These calculated results were in good accord with experimental facts that the mutant ferritin molecule showed almost no iron storage.

（20）分子ポンプの方向性を決めるもの：蛋白質はやわらかいかかたいか？

神取秀樹（名古屋工業大学）

　生体分子はその階層構造を活かし，巧みな時空間制御によって機能を作り出すことができる。例えば，膜蛋白質である分子ポンプは濃度勾配に逆らってイオンを輸送する。結果的に系のエントロピーを減少させる能動輸送という不思議な現象は，生体分子内でどのように実現しているのであろうか？　一般に能動輸送を理解するためには，蛋白質の構造を決定し，イオンや物質の輸送経路を決定した上で，方向性を決定するスイッチ機構を蛋白質の構造変化として明らかにしなければならない。最近になって次々と重要な分子ポンプ蛋白質の立体構造が決定されているにも関わらず，スイッチ機構は全くのブラックボックスである。
　高度好塩菌の光駆動プロトンポンプとして光エネルギーを電気化学的エネルギーに変換するバクテリオロドプシンの場合，発色団レチナール分子の光吸収による異性化反応が蛋白質の構造変化を誘起し，その結果としてプロトンの能動輸送が実現する。すでに立体構造とプロトン移動経路が確定し，分子ポンプ蛋白質としてはじめてスイッチ機構を原子のレベルで考えることが可能になった。このため，最先端の理論的・実験的アプローチを用いた詳細な解析が試みられている。
　本講演では，我々の低温赤外分光法を用いた研究を中心として，分子ポンプの方向性を決めるメカニズムについて議論したい。我々の主張は，バクテリオロドプシンにおけるスイッチは局在しており，ごく限られた化学結合が方向性の決定に関与するというものである。特に，演者の属する生物物理学会では，「蛋白質のやわらかさ」が最近強調されているが，決定論的な仕事をするためには「蛋白質のかたさ」が重要であるといった観点からの説明を試みる。

（21）蛋白質の振動エネルギー移動：蛋白質の非線形ダイナミクス解析への試み

木寺　詔紀（横浜市立大学総合理学研究科）

　蛋白質のダイナミクスの研究は，その構造の分布関数を記述することを主要な目的として，主に線型のモデルで解析されてきた。それに対して本研究は，時間発展を記述する目的で，非線形なダイナミクスのモデル化を試みた。
　まず絶対震度の蛋白質において，1つの高振動モードのみに小さな運動エネルギーの摂動を加えることによって，その振動エネルギーがどのように伝播していくかを分子動力学シミュレーションによって観察した。その結果，振動エネルギーは，共鳴条件を満たし，さらに十分に大きなcoupling定数を持つごく少数のモードへ移動した。これは，3，4次の低次の非線型項に起因するものであった。また，coupling係数は，ふたつのモード間の立体構造上のgeometrical overlapによって決定されることが分かった。
　次に，有限温度において，1つの高振動モード間に摂動を加えたシミュレーションを行った。有限温度では，他のモードがすべてexciteしているため，摂動後短時間で，mode-couplingによって摂動エネルギーは速やか他の多くのモードに散逸してしまい，移動に長時間を必要とする共鳴現象は見ることができない。また，他のモードへの散逸は，温度の上昇にともなって高次項の寄与が大きくなること，またガラス転移温度（≃170K）の前後でエネルギー散逸の程度が急激に増大した。これは，ガラス転移温度以上で起こる極小点を越える運動によって，他のモード空間に遷移したためである。
　このように，振動エネルギー移動を介して，蛋白質運動の非線型性を見た。これからの課題は，低振動モード空間の時間発展を正しく記述することにあると考えている。

（22）赤外領域における非線形分光法の展開

富永圭介（神戸大分子フォトサイエンス研究センター）

　赤外領域の高出力短パルスを用いた液体中の非線形分光法の開発・応用について述べる。これは赤外領域の遷移エネルビーに対する時間相関関数を詳しく調べる一つの手法であり，通常のFT-IRなどの測定では調べることができない，振動モード間の相関や遷移エネルギー揺らぎの動的挙動に関する情報を引き出すことができる。どのような手法であり，何がわかり，どのような系に応用され何がわかってきたか，ということについて講演を行う。

（23）CO結合型ミオグロビンにおけるヘム振動エネルギー緩和

長岡　正隆（名古屋大学）

　本講演では一酸化炭素（CO）結合型ミオグロビン(MbCO) のCO光解離で生じるヘムの余剰振動エネルギーの緩和過程に関して，CO解離過程を取り入れた非平衡分子動力学シミュレーションの手法を用いてエネルギー移動過程の解析して，真空中と水溶液中の二つの場合に対して比較して考察した。真空中においてヘムの振動温度は，0.84ps (66%)と18.7ps (34%)という二成分の時定数で緩和し，計算から得られた緩和の時定数が実験をうまく再現することが判った。また，振動モードの時間的強度変化を調べるために活性中心の原子群の速度自己相関関数のフーリエ変換から，時間分解されたヘムの振動モードの強度変化を計算してMbCO内の非定常過程を微視的な原子の動きとして捉えることに成功した。さらに基準振動解析の結果，ヘム側鎖のイソプロピオン酸残基の振動モードが水分子の振動モードと倍音あるいは半音であることが判った。これらの残基が溶媒である水に直接接していることから，ヘムタンパク質から溶媒へ向かう速いエネルギー緩和過程のチャネルとして重要な役割をしているはずであることを提案した。

（24）蛋白質の時間分解エネルギー・構造変化

寺嶋正秀（京都大学理学研究科）

　蛋白質の反応に限らず，化学反応一般において，反応前後のエネルギー差や分子体積変化，圧縮率や熱膨張係数などは反応を記述する基本的なデータである。ところが，熱力学量は平衡状態でのみ測定されうるものであり，非平衡的に時間発展する系に対してはこまでの伝統的手法は適用できなかった。ここでは，最近我々が提案している，反応中間体あるいは時間発展する系で，エンタルピー変化，分子体積変化，熱膨張係数を測定する方法と幾つかの例について発表する。こうした手法を，例えばミオグロビンの光リガンド解離反応に適用した結果，リガンドが蛋白から抜け出ていく真の速度や，リガンドが蛋白内に取り込まれた状態についての知見が得られることが分かった。また反応途中における熱膨張係数の変化より，中間体構造の揺らぎやすさについても時間分解した情報が得られることが可能となった。ここでは，こうした結果や，ロドプシンについてエネルギーや体積曲面を実験的に描いた結果などを報告する。

（25）ヘムタンパク質のリガンド結合部位の構造揺らぎ

水谷泰久（神戸大学分子フォトサイエンス研究センター21）

　われわれはCO光解離後1ナノ秒までのピコ秒時間分解共鳴ラマンスペクトルを測定し，鉄－ヒスチジン伸縮振動（n(Fe-His)）バンドに着目して光解離後のミオグロビンの構造ダイナミクスを調べた。その結果をまとめると以下のようになる。
　①　ν(Fe-His)振動数は，約100ピコ秒の時定数で2 cm^-1低波数シフトし，平衡状態の値へと近づいていった。高粘性の溶媒中では低波数シフトの速度は遅くなり，またタンパク部分のないヘムのモデル化合物では低波数シフトは観測されなかった。したがって，この低波数シフトは光解離後のタンパク質構造の緩和に対応するものと解釈できる。
　②　ν(Fe-His)バンドのバンド幅は，10-20ピコ秒の時定数で1 cm^-1程度の広がりを示した。われわれはこれをいまのところ，光解離後にできたCS間の非平衡な分布が緩和していく過程に対応しているのではないかと考えている。
　講演ではさらにミオグロビンにおいて観測された構造揺らぎとヘモグロビンの協同性との関連についても触れる。



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