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細胞器官研究系

生体膜研究部門

【概要】

当部門では開口放出・シナプス機能機構を2光子顕微鏡法を中心として,分子生物学的方法方法論,パッチクランプ,ケイジド試薬や電子顕微鏡を組み合わせて可視化定量化する研究を推進している。本年度はインタクトな膵臓ランゲルハンス島内の単一のインスリン開口放出を直接可視化する方法論を開発した。また,また,脳スライス標本内の中枢神経細胞を単一シナプスレベルで刺激し,形態可塑性を誘発することに成功している。

久木田文夫助手はイオンチャネルの動力学的研究を,引き続き進めている。

 

神経,分泌細胞の開口放出機構の研究

河西春郎,根本知己,高橋倫子,岸本拓也,児島辰哉,劉ていてい

調節性開口放出をインタクトな分泌臓器で定量的に可視化する方法論を,2光子励起法を用いて確立している。従来の方法とは異なり,蛍光色素を細胞外液に加えて,この色素の分泌小胞への流入によって開口放出を検知する。この方法は,細胞外の色素の濃度や状態が完全にコントロールできるので,開口放出に関係する融合細孔や小胞の性質を測定することが可能である。また,2光子励起法の同時多重染色性により,この開口放出現象への様々な分子の関与を調べることができるなど,数多くの特徴をもつ。本年は,この方法論をインタクトな膵臓ランゲルハンス島に適用して,臓器内のインスリン開口放出を検知することに成功した。その結果,臓器内の開口放出の際にも,融合細孔という半安定な小さな穴の形成があることが確認され,その穴を通る脂質の流入が細孔の開口に先行することを明らかにした。これは融合細孔が初期から膜脂質でできていることを示す新たな証拠となった。また,この過程でインスリン小胞の融合細孔は例外的に2秒ほど安定であることがわかってきており,融合細孔形成への分子機構を明らかにするのに格好な標本と考えられた。

 

2光子励起法を用いた大脳シナプスの研究

河西春郎,松崎政紀,早川泰之,野口 潤,安松信明

2光子励起法をケイジドグルタミン酸に応用して,大脳皮質錐体細胞の単一の興奮性シナプスを刺激し,更に,そのシナプスの機能を測定する方法を確立している。本年度は,この方法論で,シナプス可塑性が誘発する可能性について検討した。形態可塑性はwhole-cell clampした細胞では誘発しにくかった。そこで,スライスを培養して,gene gunでGFP遺伝子を導入し,whole-cell clampによる蛍光色素の導入無しに,形態可塑性を追跡する系を立ち上げた。Mg free溶液中で細いスパインを頻回刺激すると,刺激直後よりスパイン頭部の膨大がしばしば見られることがわかった。この膨大は10-30分で回復する傾向を見せるが,半分の例では,1時間以上に渉って持続した。この現象は非常に安定して見られるので,今後,その分子基盤や,グルタミン酸感受性の変化を調べることが可能である。

 

粘性依存性ゲート機構から予測されるイオンチャネルのダイナミックな構造

久木田文夫

イカNaチャネルやKチャネルは非電解質溶液中でその溶液粘性に比例した速度定数で構造変化を行う。この実験事実はHodgkinとHuxleyの古典的な記載にはない新しい実験事実であるが,最近の分子生物学的手法を用いたゲート機構の研究の成果により,矛盾なく説明できる。重要な点は下記の点である。

1)ゲート機構時間経過を決める重要な構造変化が水溶性部分の構造に存在する。

2)水溶性部分の構造変化は短く速いステップが無数に連続して起こることに対応し,タンパク質の主鎖や側鎖の連続的な構造変化(フォールディングやデフォールディングなど)がその主体であり,堅い構造の単純な並進・回転ではない。

このような考えは電位センサー(S4)が膜貫通セグメント(S1,S2,S3,S5,S6)で囲まれた筒(S4チャネル)をピストンのように移動するという考え方とは相容れない。しかし,最近では親水性のラベルがS4の多くの部分を修飾できることから,S4チャネルは完全な筒状ではなく,ごく一部のみが縊れて膜電位を感受できるような構造をとり,S4の他の部分は水溶液面に露出していると考えられるようになってきた。

2003年の春にMacKinnonらは好熱菌(Aeropyrum pernix)のShaker型Kチャネル(KvAP)のX線による構造解析の結果を発表した。これによると電位センサーはS4とS3の1部とS3-S4リンカーで櫂のような構造を持ち,静止時は細胞内水界面でチャネルの周辺部に位置し,脱分極時は櫂で漕ぐ時のように回転し,細胞外の水中に大きく露出することを示した(Paddle Model)。

上記のモデルで粘性依存性のゲート機構を説明するは容易である。この場合も堅い構造の電位センサーPaddleが回転するだけでは不十分で,それ自体特に水中に露出する部分の柔らかさや構造変化,ないしはS4-S5リンカーなど柔軟さ重要であると推察される。

 

 

機能協関研究部門

【概要】

細胞機能のすべては,細胞膜におけるチャネル(イオンチャネル,水チャネル)やトランスポータ(キャリア,ポンプ)の働きによって担われ,支えられている。機能協関研究部門では,容積調節や吸収・分泌機能や環境情報受容などのように最も一般的で基本的な細胞活動のメカニズムを,これらの機能分子の働きとして細胞生理学的に解明し,それらの異常と疾病や細胞死との関係についても明らかにしようとしている。主たる研究課題は次の通りである。

[1]「細胞容積調節の分子メカニズムとその生理学的役割」:細胞は(異常浸透圧環境下においても)その容積を正常に維持する能力を持ち,このメカニズムには各種チャネルやトランスポータやレセプターが関与している。これらの容積調節性膜機能分子,特に容積感受性クロライドチャネル,の分子同定を行い,その活性化メカニズムと生理学的役割を解明する。

[2]「アポトーシス,ネクローシス及び虚血性細胞死の誘導メカニズム」:容積調節能の破綻は細胞死(アポトーシスやネクローシス)にも深く関与する。これらの細胞死誘導メカニズムを分子レベルで解明し,その破綻防御の方策を探求する。特に,脳神経細胞や心筋細胞の虚血性細胞死の誘導メカニズムを生理学的に解明する。

[3]「イオンチャネルの多機能性のメカニズム」:イオンチャネルはイオン輸送や電気信号発生のみならず,環境因子に対するバイオ分子センサーや,他のチャネルやトランスポータの制御にも関与する多機能性タンパク質である。特に,CFTRの他チャネル制御メカニズムやATPチャネルの容積センサーメカニズムやNaClセンサーメカニズムについての研究を行う。

[4]「消化管上皮細胞の分泌・吸収メカニズム」についても研究する。

 

乳酸アシドーシス性の神経及びグリア細胞腫脹の持続は容積感受性アニオンチャネルの傷害による

森 信一郎,鍋倉 隆,森島 繁,岡田泰伸

脳虚血に伴われる乳酸アシドーシスは,ニューロンとグリア細胞に持続的細胞膨張をもたらして,脳腫脹とそれに続く細胞死を引き起こす。通常は一定に維持される細胞の容積が,乳酸アシドーシス環境下では持続的に増加するので,容積調節機能が障害されていることが推定された。そこで私達はこの可能性を神経分化させたNG108-15細胞と脳グリオーマ由来のC6細胞を用いて検討した。その結果,両細胞とも酸性乳酸含有液中では,図1のようなメカニズムによって膨張を示し,その膨張は長時間持続した。この条件下では,Regulatory Volume Decrease(RVD)と呼ばれる容積調節に関与する容積感受性アニオンチャネルの活性が失われていることが明らかとなった。事実,両細胞で低浸透圧条件に置いたときの浸透圧性膨張後に見られるRVDが乳酸アシドーシス条件下では見られなくなることが判明した。更には,その乳酸アシドーシス性膨張の持続は,グラミシジンによるカチオンチャネルの導入によっては影響を受けないのに対し,ピロリ菌毒素による外来性アニオンチャネルの導入によって速やかに阻止されて,正常容積に回復することが示された。これらの結果は次の2つの論文に報告した(Mori, Morishima, Takasaki & Okada 2002 Brain Res. 957, 1-11; Nabekura, Morishima, Cover, Mori, Kannan, Komune & Okada 2003 Glia 41, 247-259)。

図1.乳酸アシドーシスによる細胞膨張メカニズムとアニオンチャネル導入による回復(RVD:調節性容積減少,NVI:ネクローシス性容積増加)。

 

CFTRによる容積感受性アニオンチャネルの抑制は第2ヌクレオチド結合領域によって仲介される

赤塚結子,I.F. Abdullaev,E.L. Lee,岡田泰伸,R.Z. Sabirov

囊胞性線維症の原因遺伝子の産物であるCFTRは,ABCトランスポータのファミリーに属しながらcAMP依存症Cl-チャネルとして機能するユニークなタンパク質である。最近,CFTRは他のチャネルのレギュレータとしても働く多機能性タンパク質でもあることで注目されている。多くの細胞に発現していて容積調節に関与する容積感受性・外向整流性アニオンチャネル(VSOR)もまた,CFTRによってダウンレギュレーション(下方制御)される(図2)。ORCCアニオンチャネルやENaCナトリウムチャネルやROMK2カリウムチャネルへのCFTRの制御の場合には,第1ヌクレオチド結合領域(NBD1)が重要な役割を果していることが知られているが,VSOR制御のメカニズムは不明であった。私達は,CFTRとその種々の変異体をHEK293T細胞の形質膜に強制発現させ,VSORチャネル電流への影響を観察した。その結果,NBD1ではなく,NBD2のATP水解性のコンフォーメィションが,CFTRによるVSOR制御に不可欠であることが明らかになった。これらの結果は次の論文に報告された(Y. Ando-Akatsuka, I.F. Abdullaev, E.L. Lee, Y. Okada & R.Z. Sabirov 2002 Pflügers Arch. 445, 177-186)。

 

図2.   CFTR発現による容積感受性アニオンチャネル電流の抑制。A)保持電位0 mVから±40 mVの交互パルスをかけて全細胞Cl-電流の時間的変化を記録。B)-100 mVから+100 mVまで20 mVずつのステップパルスを(Aの星印の所で)かけてCl-電流の電圧依存性を観察。

 

アラキドン酸によるATP放出性アニオンチャネルの制御

A.K. Dutta,岡田泰伸,R.Z. Sabirov

マウス乳腺由来のC127細胞は浸透圧性膨張時に著しいATP放出を示すが,この経路は約400 pSの大型単一チャネルコンダクタンスを持つマキシアニオンチャネルVDACLであることを私達は示した(Sabirov, Dutta & Okada 2001 J. Gen. Physiol. 118, 251-266)。今回この浸透圧性ATP放出もVDACLも共に同じ生理的濃度(Kd〜5mM)のアラキドン酸で可逆的に抑制されることを示し,VDACLがATP放出を担う更なる証拠を提出した。アラキドン酸の効果はオキシゲナーゼによる代謝産物(ロイコトリエンやプロスタグランジンなど)によるものではなく,それ自身による直接効果であることが判明した。アラキドン酸は荷電型としてVDACLの細胞内側の結合サイトに結合して奏効することが明らかになった。これらの結果は次の論文に報告された(A.K. Dutta, Y. Okada & R.Z. Sabirov 2002 J. Physiol.542, 803-816)。

 


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