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1．シナプス形成とリモデリング-機能発現の分子基盤2002年12月5日-12月6日
【参加者名】 【概要】
（1）軸索成長の細胞生物学：神経接着分子と細胞骨格の動的機能上口裕之（理化学研究所脳科学総合研究センター発生・分化研究グループ） 神経軸索の形成過程に重要な神経細胞体周囲の膜様部および糸状突起，および軸索伸長過程に重要な成長円錐に存在するアクチン線維は，周辺部から細胞体方向へ後方移動し牽引力を発生する。神経接着分子の細胞外領域は，細胞外基質上のリガンドと接着し，タイヤとしての役割を果たす。同時に，接着分子細胞内領域がアクチン後方移動と結合することにより，細胞外基質へと牽引力が伝達され軸索成長が誘起される。接着分子細胞内領域とアクチン後方移動の結合は，何らかの細胞内分子（クラッチ分子）を介すると考えられている。本演題では，免疫グロブリンスーパーファミリーに属する神経接着分子L1に対して，アンキリンBがクラッチ分子として機能することを報告する。軸索が効率的に成長するためには，その先端縁が細胞外基質を強固にグリップし安定した足場を形成することが重要である。アクチン後方移動と結合した接着分子は，軸索成長に伴って形質膜上を相対的に後方へ移動してしまうため，接着分子の軸索先端縁への輸送により，先端縁形質膜の接着性を高める必要がある。接着分子の再利用には，形質膜上を前方輸送する経路と，細胞内小胞輸送を介する経路とが知られている。本演題では，軸索成長円錐における神経接着分子L1の細胞内輸送機序を概説する。以上，神経接着分子と細胞骨格の分子動態およびそれらの相互作用に関する最近の知見を紹介し，軸索成長のメカニズムを考察する。
（2）セマフォリン・プレキシンのリン酸化を介した細胞内情報伝達中村史雄（横浜市立大学医学部薬理学） 神経回路形成時に成長円錐はガイド分子によって導かれ標的器官に達する。セマフォリンは反発性のガイド分子として同定され，脊椎動物では脊髄後根神経節の成長円錐の退縮を引きおこすSema3Aとその受容体であるNeuropilin-1/Plexin-A複合体系が最も詳細に解析されている。今回Plexin-A以降の細胞内情報伝達機構について報告する。Cdk5はSema3Aの退縮反応に関与し，Sema3Aの下流分子であるCRMP2はCdk5の基質となる。さらにCRMP2のリン酸化部位変異体はSema3Aによる退縮反応を阻害する。これらの事実はSema3Aの下流でCRMPのリン酸化が重要である事を示唆する。ガイド分子の情報伝達におけるチロシンリン酸化の関与を調べる為，Plexin-Aに直接結合してチロシンリン酸化が変動する分子を検索し，100kDaの分子がSema3A刺激後，数分でチロシンリン酸化され，その後速やかに脱リン酸されることを見いだした。更にチロシンホスファターゼ（PTP）もSema3Aの情報伝達に関わると推測し，LAR型PTPがセマフォリンと関連するという仮説を立てた。現在までにLAR型PTPの1つであるPTPδがSema3Aの退縮反応を部分的に阻害すること，またPTPδに100kDaの分子が会合し，そのチロシンリン酸化量がSema3A刺激後に減弱することを見いだした。これらのことからPTPδはSema3A情報伝達系に何らかの作用を及ぼすと考え解析を進めている。
（3）シナプス小胞のグルタミン酸含量とシナプス伝達石川太郎1，山下貴之1，佐原資謹1,2，高橋智幸1 シナプス後膜に存在するAMPA受容体及びNMDA受容体が，単一シナプス小胞から放出されるグルタミン酸によって飽和されるという仮説（飽和仮説）が正しいとすると，シナプス小胞のグルタミン酸含量が増したとしてもシナプス伝達効率は増大しない。この仮説をラット脳幹スライスの巨大シナプス（the calyx of Held）において検証した。シナプス前末端のパッチ電極に1 mMのL-グルタミン酸を加えたときにMNTB細胞からホールセル記録されるAMPA-微小（m）EPSCの振幅は，シナプス前末端に記録電極がないときの振幅と同程度であった。これに対し，100 mMのL-グルタミン酸をシナプス前末端の電極に負荷して記録されるAMPA-mEPSCの振幅は通常の約1.5倍であった。シナプス前末端とMNTB細胞から同時記録を行い，前末端内のL-グルタミン酸の濃度を電極内潅流法によって1 mMから100 mMに増大させたところ，AMPA-EPSCとAMPA-mEPSCの振幅がいずれも著明に増大した。また，0 mM Mg2+潅流液中で記録されるNMDA-mEPSCとNMDA-EPSCの振幅も著明に増大した。以上の結果から，calyx of Heldシナプスの単一シナプス小胞に含まれるグルタミン酸はシナプス後膜のAMPA受容体及びNMDA受容体のいずれも飽和させず，シナプス小胞のグルタミン酸含量によりシナプス伝達の効率が調節され得ると結論される。
（4）中枢シナプスの神経伝達物質共放出鈴木紀光（神戸大学大学院医学系研究科脳科学講座細胞神経生理） 中枢神経系では，1つのneuronは1つのfast neurotransmitterを有するという原則が知られていた。しかしながら近年になりその理解の変更を求められている。小脳ゴルジ細胞は，顆粒細胞とシナプス結合し，その終末から抑制性神経伝達物質のGABAを放出する。一方，ゴルジ細胞は細胞体およびシナプス終末にGABAのみならず，別の抑制性神経伝達物質のglycineを含むことが形態学的に報告されている。今回，ゴルジ細胞のもうひとつの標的細胞と推測されるunipolar brush cell (UBC)の抑制性入力に着目した。10-14日齢のマウス小脳スライスのUBCからホールセル記録を行い，抑制性シナプス後電流(IPSC)を記録した。刺激誘発性および自発性IPSCにGABAA受容体媒介性の成分と同時にglycine受容体媒介性の成分が存在することを確認した。ゴルジ細胞とUBCのpaired recordingを行なって検討した結果，ゴルジ細胞がUBCに対し抑制性シナプスを形成し，シナプス前終末からGABAとglycineを同時に放出していることを観察した。さらに微小シナプス後電流(mIPSC)の解析の結果，ゴルジ細胞神経終末のシナプス小胞の一部はGABA，glycineを同時に含有していることが示唆された。本研究会では Daleの法則が提唱されてからの簡単な歴史について形態学あるいは電気生理学の報告を交えながら説明し，最近までの様々な知見を包括的に紹介する。
（5）神経シナプスactive zone形成の分子メカニズム大塚稔久（カン研究所） 神経シナプスのcytomatrix at the active zone (CAZ)には，RIM1, Munc13-1, piccoloおよびbassoonなどの細胞骨格蛋白質が存在し，active zoneの形成，構造維持および機能発現に重要な役割を果たしている。最近，私共は，ラット大脳より新規CAZ蛋白質CASTを同定しその機能解析を行った。CASTは957のアミノ酸からなり，複数のcoiled-coil領域とC末のPDZドメイン結合モチーフを有している。CASTは，そのC末でRIM1に直接結合し，かつRIM1を介してMunc13-1と結合して3者複合体を形成する。また，CASTおよびRIM1の欠失変異体の解析から，CASTがRIM1のactive zoneにおけるanchoring蛋白質であることが示唆された。さらに，bassoonもこの3者複合体に直接もしくは間接的に結合する事から，電子密度の高いCAZは，このような蛋白質-蛋白質相互作用のネットワークをその分子基盤としている事が示唆される。前半は，このCASTのデータを中心にactive zone形成の分子メカニズムについて話題を提供したい。また，後半では，シナプス小胞のclustering制御因子として線虫で同定された蛋白質SAD-1のヒトホモログの機能解析について報告し，シナプス小胞のactive zoneへのtargeting mechanismについても話題を提供したい。さらに，古典的な生化学と質量分析法を用いて同定した新規のPSD蛋白質についてもいくつかのデータを紹介する。
（6）体性感覚野マップ精緻化の分子機構：マウス逆遺伝学的解析岩里琢治 マウス大脳皮質体性感覚野には，末梢体性感覚器であるヒゲの分布に対応した，『バレル』と呼ばれる構造が存在する。バレルは，視床-皮質軸索終末と第４層神経細胞から構成され，活動依存的神経回路発達のモデルとして注目されてきた。私達は最近，Cre/loxP組換えシステムを利用し，大脳皮質の興奮性神経細胞に限定してNMDA受容体を欠損するマウス(CxNR1KOマウス)を作製した。このマウスの大脳皮質では，第4層神経細胞のパターン化が起きず，また視床-皮質軸索のパターン形成も異常になる(Iwasato et al., 2000, Nature 406, 726-731)。NMDA受容体の活性化からバレル形成に至る分子機構を更に理解するため詳細な形態学的解析を行なった。幼弱マウスのヒゲ傷害時の視床-皮質軸索の可塑性を解析した所，CxNR1KOマウスと野生型マウスとの間に有意差はなく，この部位の可塑性はNMDA受容体を介した逆行性シグナルに依存しないと考えられた。更に第4層神経細胞の樹状突起の形態をゴルジ染色によって解析した。正常マウスでは樹状突起は一つのバレルに限局し非対称的な形態を示すが，CxNR1KOマウスでは方向性を持たず放射状に伸展し，スパイン密度も有意に高かった。これらの結果は，大脳皮質のNMDA受容体の活性化が，不適切な樹状突起の成長抑制を介して樹状突起の方向性を決定し，それによってヒゲと第4層神経細胞の1対1対応が形成されることを強く示唆する。
（7）匂い地図形成におけるセマフォリンの機能谷口雅彦 嗅上皮に存在する嗅細胞は多数の嗅覚受容体の内1種類だけを発現しており，同種の嗅覚受容体を発現する嗅細胞の嗅神経は，嗅球に存在する約1800個の糸球体の内わずか2〜数個の糸球体に正確に投射・収束する。このように糸球体の空間配置は嗅球における「匂い地図」を形成する。しかし，正確な匂い地図形成の分子メカニズムはほとんど分かっていない。セマフォリンは神経軸索ガイダンスにおいて重要な分子である。私は以前セマフォリン3A(Sema3A)のノックアウトマウス(-/-マウス)を作成したが，Sema3Aおよびそのレセプターであるニューロピリン-1（NP-1）が嗅覚系に発現する，という理由等から匂い地図形成におけるSema3Aの機能に注目して現在研究を進めている。抗OCAM抗体と抗NP-1抗体を分子マーカーとして使用し，成体Sema3A-/-マウスの匂い地図形成を解析した。野生型マウスでは，NP-1を発現している嗅神経は特定の糸球体に投射し限局したパターンを形成する。しかし，Sema3A-/-マウスにおいてはNP-1陽性の糸球体は嗅球全体に広がっていた。また抗OCAM抗体による匂い地図においても，-/-マウスにおいて異常が認められた。さらにoptical imaging法を用いて嗅球背側の神経活動を解析した結果，-/-マウスにおける異常を明らかにした。以上のことより，Sema3Aは嗅球において正確な匂い地図を形成するために必須であることが示された。
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