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18．電子位相顕微鏡法の医学的・生物学的応用2003年3月12日-3月15日
【参加者名】 【概要】
（1）EXPANDING PROTEIN STRUCTURE WORLD BY HIGH PRESSURE NMR. Characterization of reactive conformers of the prion protein赤坂一之（近畿大学生物理工学部生物工学科） A protein in solution is a thermodynamic entity, spanning, in principle, the entire conformational space from the fully folded N to the fully unfolded U. Although some alternately or partially folded higher energy conformers may coexist with N and U, they are seldom detected spectroscopically because their populations are usually quite low under physiological conditions. I describe here a new type of experiment, a combination of multi-dimensional NMR spectroscopy with pressure, that is capable of detecting and analyzing structures and thermodynamic stability of these higher energy conformers. The idea is based on the finding that under physiological conditions the conformational order of a globular protein normally decreases in parallel with its partial molar volume (negativeDV), so that under equilibrium conditions, the population is shifted to a less and less ordered conformer with increasing pressure. With the high space resolution of the multi-dimensional NMR, the method enables one to explore protein structure and stability in atomic detail in the entire conformational space from N to U with pressure and temperature as variables. The method will provide us with a strong basis for understanding the basic phenomena of proteins; function, folding and misfolding. Indeed, most globular proteins studied to date showed the presence of higher energy conformers either with an alternate fold or with local unfolding in addition to the unfolded conformer, suggesting that higher energy conformers are part of the design of most globular proteins. It is probable that the presence of these conformers is crucial for their function. An intermediate conformer of hamster prion protein was recently discovered by this technique, which is likely to be an obligatory intermediate to the Scrapie-type prion.
（2）ULTRASTRUCTURAL ANALYSIS OF THE CEREBRAL AMYLOID DEPOSITION山口晴保（群馬大学医学部保健学科） アルツハイマー病に特徴的な病理所見である脳βアミロイド沈着の臨床的意義と，その超微形態について概説した。 脳βアミロイド沈着は，加齢に伴って40歳代から正常中高年者の脳に出現する。そして，10〜20年をかけて，βアミロイド沈着量が増加するとともに，神経原線維変化が加わりシナプスが減って痴呆を発症する。 βアミロイド沈着初期は，瀰漫性老人斑の形をとり，ごく少量のβタンパクが沈着している。この時期の老人斑は異常な形態を示さない，通常電顕で観察しても見いだすことができない。そこで，隣接切片を免疫染色する方法や，電顕切片を直接免疫染色する方法で，瀰漫性老人斑内におけるβアミロイド沈着の超微形態を観察した。すると，初期のβアミロイド沈着は線維の形態を示さず，細胞突起の膜が金標識されただけであった。このことから，βタンパクは膜結合βタンパクとして沈着を開始することを示した。そして，この膜結合βタンパクが種となって多量のβタンパクが重合蓄積すると，細胞突起間にアミロイド線維が出現することを示した。 また，この研究過程で，reflection contrast microscopeを用いると，電顕用超薄切片をスライドグラスに載せて直接光顕観察することができ，免疫電顕を効率よく進める上で有用な機材であることを示した。
（3）Pressure Dissociates Amyloid-fibrillogenic Assembly of Disulfide-deficient Lysozyme Variant橘 秀樹（神戸大学理学部） アミロイド様繊維の形成はプリオンなどの病原性蛋白質に限られたことではなく，蛋白質一般の性質ではないかと，近年考えられてきている。アミロイド様繊維構造形成には，蛋白質の立体構造が部分的にアンフォールドした中間体が関与していると考えられているが，詳細は明らかではない。一方，ジスルフィド結合を持つ蛋白質の場合，還元変性した分子種は一般に自己凝集する性質を持つが，この反応の詳細もまた十分には明らかにされていない。ここでは，天然状態でほぼアンフォールドしている，すべてのジスルフィド結合を欠損させたリゾチーム変異蛋白質が，17 Sの沈降係数の，分子間b構造を含む可溶性会合体を形成することを報告する。この会合体は長期間のインキュベーションによりアミロイド様繊維を自発的に形成した。最近開発され，蛋白質研究に応用されつつある高圧NMR測定を行った結果，17 S会合体はリゾチームモノマーあたり約23 kJ molÐ1の安定性を持ち，53 ml molÐ1の体積減少を伴って高圧によって解離することが示された。さらに，この会合反応には複数の疎水性残基が関わっていることが示唆された。これらの結果は，アミロイド様繊維形成に特定の部分構造を持つ中間体が必須ではないこと，加圧による凝集体解離がアミロイド繊維形成を予防すること，蛋白質残基レベルでのアミロイド繊維形成初期過程の研究に高圧NMR法が有用であること等を示すものである。
（4）Perspectives in Alzheimer’s disease diagnosis荒井啓行（東北大学医学部老年・呼吸器病態学講座） 正常と痴呆の間の知的グレイゾーンは，米国を中心にMild cognitive impairmentと呼ばれアルツハイマー病に進行する可能性の高い危険水域と見なされている。平成11年から本邦でも臨床の現場にアルツハイマー病治療薬としてのコリンエステラーゼ阻害薬が登場したことは，患者サイドでは「今は症状が軽くても将来進行する恐れがあるならば，今の内から予防のための薬物治療を始めたりライフスタイルの是正を試みたりして少しでも進行を遅らせたい」という認識を生み出した。物忘れが次第に気になってくる場合，患者はこれまでのような状態像の評価のみならず，現時点での積極的な診断・治療を求めて医療機関を訪れる。東北大学老年科では，MRIによる血管病変の評価および面接による記銘力検査と伴に脳脊髄液タウ測定と神経機能画像などのBiomarkerを用い，その結果を患者またはその家族に説明している。100％言いきることは困難としても，感度の高いこれらの検査成績に異常がないことを聞いて安心する患者も多い。これがBiomarkerの第1義的な臨床的有用性であろうと考えている。今後，痴呆症を克服していくには，病態に基づいた信頼できるBiomarkerを開発し，無症候段階からの予防医学的介入が重要になってくると思われる。
（6）Image Enhancement with Phase Plates in Electron-Phase Microscopy永山國昭（統合バイオサイエンスセンター） 位相差法の開発について過去3年間の研究結果を報告した。i）2つの位相差法（ゼルニケ位相差法と差分コントラスト法）の開発：ゼルニケ位相差法に用いるカーボン膜は直径100mm，厚さ30nmで中央に約1mmの円孔があいている。300kVの加速電圧のとき透過電子の位相がp／2後れるように調整されている。一方差分コントラスト法（光学顕微鏡の微分干渉コントラスト法と等価）では厚さ約60nmの半円カーボン膜が用いられた。膜厚は電子の位相が300kV加速電圧に対しp後れるように調整されている。両者ともコントラスト伝達関数がcos型となり，原点付近の空間周波数が通常法に比し回復するので，極めて高い像コントラストを生む。この強いコントラストは生物試料の無染色観察に有利であり，細胞切片や蛋白質への応用例について報告した。ii）位相板帯電除去法の開発：電子位相法の大敵は位相板の帯電である。歴史的に見るとこの深刻な障害のために位相差法が実用化されてこなかった。位相板の徹底的なクリーン化と位相板の電子顕微鏡内常時高温保持により問題解決を図ったことを報告した。 【文献】
（7）NEW PHASE PLATE SYSTEM APPLIED TO THE 120KV TEM細川史生，新井善博（日本電子（株）） 透過電子顕微鏡（TEM）への，光学顕微鏡と同様な効果をもたらす位相板の応用に関して，応用の実現を困難たらしめていた種々の問題点の解決手段を備えた120kVタイプTEMを開発し，その装置概要とp/2位相板がコントラスト改善に明確な効果を示す応用データを紹介した。TEMにおける位相板が過去において実用化されてこなかったのは，位相板へのビーム照射中に堆積する汚れ，および，汚れを原因とした電荷のチャージが最大の原因と考えられる。細心の注意をもって作成した約15nmの一様な厚みをもつカーボン膜を位相板とし，これをTEMの加熱ホルダーにてTEM鏡筒内に保持し約200℃で加熱しつつ使用することで，汚れとチャージの問題は無くなった。また，対物レンズ周りに位相板用に新たに設計した光学系を設置し，位相板がTEMの基本性能を阻害すること無く，同時に，位相板としての効果を最大限発揮できるよう考慮した。アモルファス試料のパワースペクトルの変調を解析することで，p/2位相板を用いた場合，透過波と散乱波にp/2の位相差が付加されることが確認できた。p/2の付加的な位相差により，通常のTEMでは観察困難な（重金属染色のない）生物切片が十分なコントラストで結像できることを確認した。
（8）Real-Time Phase Transmission Electron Microscope高井義造，西方健太郎，川崎忠寛，木村吉秀（大阪大学大学院工学研究科） 高分解能透過型電子顕微鏡に浮遊型加速電圧変調システムと高速画像処理機能内蔵型CCDカメラを組み合わせることで，実時間位相差透過電子顕微鏡を完成させた。この新しい電子顕微鏡では高速に加速電圧を変調しながら画像を収集し処理することで，球面収差の影響を補正した位相差像を1/30秒の時間分解能で表示することができる。分解能は球面収差の補正効果により，0。27nmから0。14nmに向上させることができ，結晶表面や界面の原子構造を収差を含んだオリジナル像より正確に再現することが可能である。 本研究では，この新しい装置を用いて金結晶表面の原子のFlip-Flop運動や協調的な集団運動，ならびに原子鎖の形成とその振る舞いを観察した結果を報告する。特に原子鎖の球面収差補正位相像観察とその動的な振る舞い，および格子点間距離の解析により，切断される直前に観察された原子鎖は単原子で形成された原子鎖であることが確認できた。
（9）Cs-CORRECTION WITH COMPLEX OBSERVATION IN TEMRadostin Danev，永山國昭（統合バイオサイエンスセンター） Phase imaging with Conventional Transmission Electron Microscope (CTEM) is characterized by severe image modulation. Contrast Transfer Function (CTF) is usually used for modeling of the image formation. The most important parameters in the CTF are defocus and spherical aberration of the objective lens. For reconstruction of the complete, distortion-free phase information several CTEM photos taken at different defocus values are usually used The recent developments in the application of Zernike phase plate to TEM can make possible the application of the proposed Complex Reconstruction scheme. This scheme requires only two photos of the object: one taken with Phase TEM (PTEM) utilizing a Zernike phase plate and one taken with CTEM. Complex summation and consequent CTF demodulation give as a result the complete phase and amplitude object information. Experimental results are presented and practical aspects of the technique are discussed.
（10）THREE-DIMENSIONAL STRUCTURAL ANALYSES OF FREE AND ACTIN-ASSOCIATED MYOSIN HEADS IN FUNCTION片山栄作，市瀬紀彦（東京大学医科学研究所分子構造解析生体分子イメージング） われわれは，急速凍結フリーズレプリカ試料から蛋白質複合体の3次元構造解析するために新たに開発した手法を用いて，in vitro滑り運動中のウサギ・アクトミオシン複合体中でしばしば観察され，アクチンフィラメントを抱き込む形で結合するミオシン頭部の構造解析を行った。ミオシン頭部はATP結合により強く屈曲するが，そのX線結晶構造から予測されるシミュレーション画像は上記のアクチン結合ミオシンの画像とは合致しない。そこで，不安定な中間状態において2価性試薬(pPDM)で化学架橋を施したミオシン頭部のレプリカ画像を捉えてその3次元構造を解析したところ，滑り運動中のアクチン結合ミオシンの画像と酷似することが判明した。その構造は上記の屈曲した結晶構造のレバーアーム部分をほぼ逆方向に回転させることにより得られるものであった。一方，pPDMで架橋したホタテ貝ミオシン頭部のX線結晶構造がごく最近発表され，ADP結合ミオシンに近いと結論されているが，その構造はわれわれが見出したものとは全く異なる。ウサギ・ミオシンではpPDMによる架橋はSH-1，SH-2と称される2個のチオール基をつなぐが，ホタテ貝ミオシンではSH-2と近傍のリジンが架橋されることが分かっている，これらのことから，種の異なるミオシンの架橋産物が別の構造を取っているものと考えれば説明可能であろう。軽鎖中のSH基に入れた蛍光標識のスペクトルの特徴も同様のことを示唆している。
（11）Dynamics of Cell Membrane Proteins and Lipids as Revealed by Freeze-Fracture Replica Labeling Electron Microscopy藤本 和1,2,3，小川智史3，村手源英2,3 従来，膜脂質についての細胞化学的研究は困難であるとされてきた。私たちは凍結割断レプリカ標識法によって，赤血球，肝細胞や膵腺房細胞などの組織細胞におけるフォスファチジルコリン（PC）の局在を検討し，形質膜のみならず，ミトコンドリアや小胞体などの細胞内小器官の膜のEF-面に選択的に免疫金粒子の結合が観察されるが，PF-面には全く金粒子の沈着が見られないか，あってもごく少数が観察されるのみであることを示した。この所見は，PCが膜の外葉に主として存在する，非対称性の分布をしていることを明瞭に示唆した。興味深いことに，このようなPCの非対称性の分布が膜融合の際に，消失し，対称性の分布になることを見出した。また，スフィンゴミエリン（SM）の免疫標識において，免疫金粒子は細胞膜のEF-面に多く，かつ均一に観察されたが，PF-面では数個から数十個の金粒子が凝集して結合している像が観察される。これらの所見はSMが細胞膜の外葉に主として存在するが，内葉ではSMがクラスターを形成して存在していることを示唆した。さらに，Tリンパ球の抗原受容体（TcR）がSMのクラスラ領域とよく一致した分布をしていることが分かった。現在，SMのような脂質分子と種々の膜機能分子の局在の関連性について，検索中である。
（12）Torque-speed relationship of the Na+driven flagellarmotor石島秋彦（名古屋大学大学院工学研究科） バクテリアべん毛モーターは，生物界において回転機構を有する数少ない生体分子モーターである。我々は，回転メカニズムを解明するために，様々な負荷を与えた状態でのモーターの回転をナノメーターレベルでの計測を行った。 回転の計測には，べん毛部にポリスチレンのビーズを固定し，その位相差像を4分割フォトダイオードに投影することにより行った。様々なサイズのビーズを固定した状態での回転速度を計測することにより，モーターに様々な負荷を与えることができる。その結果，発生トルクは低回転域では一定となり，それ以上の回転域において減少する傾向となった。さらに，外液のナトリウム濃度を変化させたときの回転速度―トルク関係を計測した。トルク，回転速度ともに外液ナトリウム濃度に大きく依存し，ナトリウム濃度を下げると，トルク，回転速度ともに減少する傾向を示した。 その結果をもとに，単純な4状態モデルで再現することを試みた。まず，電気化学ポテンシャルが回転，トルクに直接関係するというモデルを元に再現を試みたが，外液のナトリウム濃度を変化させたときの結果を再現することはできなかった。そこで，我々はさらにモーター固定子へのイオンの結合，解離をふまえたモデルを検討した。その結果，外液のナトリウム濃度の変化でのトルク−回転速度関係を実現することが可能となった。つまり，モーターの回転メカニズムを考える上で，単純な電気化学ポテンシャルだけでなく，イオンの結合・解離を考慮に入れなくてはならないことが明らかになった。
（13）Electron Cryomicroscopy of Bacterial Flagellar Structures米倉功治（大阪大学大学院生命機能研究科， 細菌の遊泳のための回転モーターであるべん毛は，約25種類の蛋白質からなる超分子複合体である。それは，細胞の外膜と内膜を貫く基部体，トルク生成に関わるイオンチャネルや，細胞外では，一種類のタンパク質フラジェリンの重合によって10μm以上にも伸張するべん毛繊維，べん毛繊維先端のキャップ蛋白質等から構成される。このような超分子複合体の構造の解明には電子顕微鏡法が適しており，また必須でもある。 最初に，べん毛繊維とキャップの複合体構造の低温電子顕微鏡法による解析から得た，フラジェリンの結合の度にキャップが回転し新たな場所に次の結合部位を形成するという，べん毛繊維伸張のダイナミックなモデルについて発表した。次に，直線型べん毛繊維のらせん対称性を利用した解析から得た，約4Å分解能の構造について報告した。得られた構造からフラジェリン全長からなるべん毛繊維の原子モデルを構築した。その結果，フィラメント内側のcoiled-coilを形成する2本のα-ヘリックスが，他のサブユニットと疎水性相互作用し繊維を安定化させていること，べん毛繊維中央のフラジェリン輸送チャネル壁の親水的性質が，アンフォールド状態のフラジェリン分子の素早い輸送に重要であること等がわかった。
（14）Switching and self-assembly of the bacterial flagellum難波啓一（大阪大学大学院生命機能研究科ERATOプロトニックナノマシンプロジェクト） 細菌べん毛は回転機構や形態変換スイッチ機構をもつ蛋白質ナノマシンである。細胞外へ伸びる細長いべん毛繊維はらせん型の回転プロペラで，根元の高速回転モータによって回転することにより推進力を産み出す。この細長いらせん型繊維構造は一種類の蛋白質フラジェリンから構築されたチューブ構造で，11本の素繊維からできているが，各素繊維の周期構造（周期約52Å）をわずか0。8Åだけ変化させ，同時に素繊維間の相互作用を2Åほど素繊維に沿ってずらして2状態構造を実現し，その2状態間をスイッチする事により，様々な形態のらせん構造の曲率とねじれを産み出している。電子顕微鏡，X線繊維回折，X線結晶構造解析法を組み合わせて得たべん毛素繊維の構造から，その曲率を産み出す素繊維周期構造のメカニカルな高精度スイッチ機構が明らかになった。べん毛繊維の構造を安定化するフラジェリン両末端ドメイン（D0）を取り除いて得られたX線結晶構造には，周期構造の異なる2状態の素繊維構造（L型52。7Å，R型51。9Å）のうち，R型の構造が含まれていた。そこで，このR型素繊維モデルの原子座標を用いて計算機による素繊維伸長シミュレーションを行い，この力学的ナノスイッチがコアドメイン（D1）のサブユニット間接触部位にあるβヘアピンのわずかな構造変化であることを同定した。また，極低温電子顕微鏡による解析を進め，画像解析の様々な工夫によって，わずか41,000個の分子像を平均することにより4Å分解能の電子密度図を得た。それを基にべん毛繊維の全構造に対する原子モデルを構築し，繊維構造の形成機構や突然変異による直線型繊維構造形成のしくみを解明した。
（15）Correlated Light and Electron Microscopy for Immunohistochemistry and in situ Hybridization; with Special Reference to Structure and Function of the Stigmoid Body篠田 晃（山口大学医学部高次神経科学講座） 現在我々は，免疫組織化学(IHC)とin situ hybridization(ISH)の増感法の開発に加え，組織保持向上のための高濃度グルタ-ルアルデヒド使用，浸透性向上のための界面活性剤使用，エポン内扁平包埋法の採用等により中枢神経等ヘテロな組織での電顕解析に有用な光顕電顕相関型免疫電顕法(IHC-EM)とISH電顕法(ISH-EM)の開発に成功している。こうした方法によって，脳内辺縁系-視床下部領域に広く分布するニュ-ロン内細胞質封入体“斑点小体stigmoid body”が見出され，その構造と機能の解析がなされた。斑点小体はhPAX-P2抗体によって標識される1-3μmの顆粒繊維状封入体で，Huntingtin-associated protein 1 (HAP1)が局在することが知られる。ハンチントン病の原因遺伝子であるHuntingtinが神経変性の標的部位である線条体のみならず脳全体に発現する一方，HAP1は神経変性を免れる視床下部，辺縁系領域に発現する事実と，HuntingtinとHAP1の同時遺伝子導入法の結果よりHAP1・斑点小体の発現がHuntingtinによる神経変性に対し抑制効果を示す可能性を我々は示唆している。また，HAP1cDNAをastrocytesやHEK293に導入することで，培養細胞内小体に斑点を誘導することに成功し，さらにISH-EM法による解析で，HAP1ｍRNAが斑点小体内に局在することの証明に成功した。これらは，HAP1が斑点小体の形成に重大な関与をすると同時に，斑点小体内でHAP1のｍRNAからの合成が行わることを強く示唆する。
（16）Number and Density of AMPA-Type Glutamate Receptors in Synaptic Sites: Corresponding Studies of Electrophysiology and Freeze-Fracture Replica Labelling重本隆一（生理学研究所脳形態解析） 凍結割断レプリカ法は細胞膜割断面の2次元的な形態観察に有力な方法として長く用いられてきたが，レプリカ上で蛋白質を同定する方法は限られていた。近年，福井県立大学の藤本和教授によって，凍結割断レプリカ上で免疫標識を行う新しい方法，SDS-digested freeze- fracture replica labeling (SDS-FRL)法が開発され，多くの膜蛋白質の分布解析がレプリカ上で可能となった。この方法をさらに改良し，中枢神経系において神経細胞のAMPA受容体分子の分布を高感度で定量的に解析した。 生後3-4日令の小脳分子層に存在するシナプスは登上線維―プルキンエ細胞シナプスのみであるので，この領域の興奮性シナプスをすべて集め，AMPA受容体による金標識の数と密度を解析した。その結果，登上線維―プルキンエ細胞シナプスには非常に均一な約1000 particles/mm2の標識が認められ，シナプス間の密度のばらつきも非常に少なかった（CV=0.2）。この結果より，これらのシナプスにはほぼ一定の密度でAMPA受容体が存在していることが明らかとなった。さらに金標識の密度が，電気生理的解析から得られた受容体チャネルの密度（900 channels/mm2）に近いことから，1個の受容体につきほぼ1個の金標識が対応するという，高感度を達成していることが明らかとなった。
（17）The Claudin Family: A Key Player in the Barrier Function of Epithelium/Endothelium in Multicellular Organisms月田承一郎（京都大学大学院医学研究科分子細胞情報学） 多細胞生物体の生命維持のためには，まず上皮細胞シートにより，外部環境と大きく異なる内部環境を保たなければならない。さらに，それぞれの個体は，環境の大きく異なるいくつもの部屋に分けられている。これらの部屋を仕切る壁，すなわちバリアーとして働くのは，やはり上皮細胞シート，内皮細胞シートである。しかし，これらの細胞シートを構成する細胞の間から水分子やイオンをはじめとする物質が漏れれば，バリアーの役割を果たせない。細胞間からの物質の漏れを防ぐために，タイトジャンクション（TJ）と呼ばれる細胞間接着装置が存在する。ここでは，隣り合う細胞間の距離がほぼゼロになるまで細胞膜が近づいており，細胞間をシールしている。さらに，このTJは上皮細胞の極性の形成・維持にも決定的な役割を果たしていると考えられている。したがって，このTJで機能する接着分子は，個体形成の上できわめて重要な分子であると考えられ，古くからその実体が追い求められてきた。我々は，数年前に，このTJの接着分子として4回膜貫通蛋白質であるクローディンを見出した。クローディンは大きな遺伝子ファミリーを形成し，TJのバリアー機能を直接担う蛋白質であることが明らかになってきた。ここでは，クローディンに関する最近の知見，特に，ノックアウトマウスの作製から明らかになってきた知見を紹介し，多細胞生物における上皮のバリアー機能の重要性について論じた。
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