【概要】
当部門では開口放出・シナプス機能につき，2光子顕微鏡法を基軸として，分子生物学的方法論，パッチクランプ，ケイジド試薬や電子顕微鏡を組み合わせて可視化定量化する研究を推進している。膵臓ランゲルハンス島におけるインスリン開口放出様式の定量解析により，逐次開口放出の抑制されている事実が明らかとなり，副腎髄質クラスター標本やPC12細胞・膵外分泌標本との著しい差異が同定された。また，脳スライス標本内の中枢神経細胞において，ケイジドグルタミン酸の光活性化法により，単一シナプスレベルで刺激を与え，形態可塑性の誘発に成功している。この可塑性は長期増強と薬理学的性質が同じであることが明らかとなった。
河西春郎，根本知己，高橋倫子，岸本拓也，
兒島 辰哉，大嶋 章裕，劉婷婷，畠山 裕康
2光子励起法の深部到達性を利用して，調節性開口放出をインタクトな分泌臓器内部で定量的に可視化する方法論を確立している。従来の方法とは異なり，蛍光色素を細胞外液に添加し，この色素の分泌小胞への流入によって開口放出を検知する。本法により，膵外分泌・副腎髄質組織およびPC12細胞などでは，複数の顆粒が単一の融合細孔を共有する複合型の開口放出によって，分泌の大半が起こっている事実を見出している。他方，インスリンを分泌する膵島においては，この種の複合型開口放出が著しく抑制されている特徴をもつことが判明した。本法の同時多重染色性の併用により，開口放出現象への様々な分子の関与の調査を進めている。
河西春郎，松崎政紀，早川泰之，野口 潤，安松 信明，本蔵直樹
2光子励起法をケイジドグルタミン酸に応用して，大脳皮質錐体細胞の単一の興奮性シナプス後部（スパイン）を刺激することに成功している。更に，スライスを培養して，gene gunでGFP遺伝子を導入した標本を用いることにより，反復的なグルタミン酸投与により，スパインの頭部が増大する現象を発見した。この頭部増大現象は電気刺激でも誘発されたが，その場合にはまばらにしか起きず，刺激されたスパインで選択的に起きていることが確認できない。これに対して，2光子励起グルタミン酸法を用いた場合には，刺激したスパイン選択的に9割以上のスパインで誘発することができる。そこで，この現象の薬理学的な性質を調べた。頭部増大には持続が20分程度の短期相と，1時間常時属する長期相がある。このいずれの相もNMDA受容体の阻害剤(APV)及びカルモヂュリンの阻害剤で完全に消失した。また，やや高濃度のアクチン重合阻害剤でも完全に消失した。これに対して，カルモヂュリンキナーゼIIの阻害剤は長期相のみを選択的に阻害した。同様な阻害は低濃度のアクチン重合阻害剤でも観察された。従って，スパインの頭部増大はNMDA受容体を介したカルシウム流入によりカルモヂュリンが活性化されることにより，アクチン重合が起きることによると考えられた。また，長期相はカルモヂュリンキナーゼIIとより精巧なアクチン重合を必要としていると考えられる。この様にスパイン頭部増大の長期相の薬理学的な性質は長期増強のそれと一致した。
【概要】
細胞機能のすべては，細胞膜におけるチャネル（イオンチャネル，水チャネル）やトランスポータ（キャリア，ポンプ）の働きによって担われ，支えられている。機能協関研究部門では，容積調節や吸収・分泌機能や環境情報受容などのように最も一般的で基本的な細胞活動のメカニズムを，これらの機能分子の働きとして細胞生理学的に解明し，それらの異常と疾病や細胞死との関係についても明らかにしようとしている。主たる研究課題は次の通りである。
(1)「細胞容積調節の分子メカニズムとその生理学的役割」：細胞は（異常浸透圧環境下においても）その容積を正常に維持する能力を持ち，このメカニズムには各種チャネルやトランスポータやレセプターが関与している。これらの容積調節性膜機能分子，特に容積感受性クロライドチャネル，の分子同定を行い，その活性化メカニズムと生理学的役割を解明する。
(2)「アポトーシス，ネクローシス及び虚血性細胞死の誘導メカニズム」：容積調節能の破綻は細胞死（アポトーシスやネクローシス）にも深く関与する。これらの細胞死誘導メカニズムを分子レベルで解明し，その破綻防御の方策を探求する。特に，脳神経細胞や心筋細胞の虚血性細胞死の誘導メカニズムを生理学的に解明する。
(3)「イオンチャネルの多機能性のメカニズム」：イオンチャネルはイオン輸送や電気信号発生のみならず，環境因子に対するバイオ分子センサーや，他のチャネルやトランスポータの制御にも関与する多機能性タンパク質である。特に，CFTRの他チャネル制御メカニズムやATPチャネルの容積センサーメカニズムやNaClセンサーメカニズムについての研究を行う。
(4)「消化管上皮細胞の分泌・吸収メカニズム」についても研究する。
岡田泰伸，サビロブ ラブシャン
腎臓の傍糸球体装置では，マクラデンサ細胞が尿細管腔のNaCl濃度を検知して，その情報を隣接するメザンギウム細胞から平滑筋に伝達し，糸球体に流入する動脈血流量を調節している（尿細管糸球体フィードバック）。しかしNaClセンサーやその下流のシグナルの実体については不明であった。今回，私達は尿細管腔のNaCl濃度上昇に応答してATPを放出するマキシアニオンチャネルがマクラデンサ細胞に存在し，放出されたATPがメザンギウム細胞にCa2+上昇を引き起こすシグナル分子として働くことを明らかにした。また，マクラデンサ細胞にCa2+活性化型の非選択性チャネルが存在することも見出した。Ca2+活性化型カチオンチャネルとマキシアニオンチャネルが協調的に働いて，尿細管糸球体フィードバックの中心的役割を果たしているものと考えられる。以上の結果は次の2つの論文に発表された(Bell, Lapointe, Sabirov, Hayashi, Peti-Peterdi, Manabe, Kovacs & Okada 2003 PNAS 100:4322-4327; Lapointe, Bell, Sabirov & Okada 2003 Am. J. Physiol. 285:F275-F280)。
図：傍糸球体装置(A)とNaClセンサー及びシグナル伝達メカニズム(B)
張暁東，高橋信之，井上 華，清水貴浩，岡田泰伸
森島 繁（福井医科大学医学部・薬理学講座）
赤塚結子（三重大学医学部・生理学講座）
鍋倉 隆（宮崎医科大学医学部・耳鼻咽喉科学講座）
クロライドチャネルはグリア細胞において重要な役割を担っているが，ClC-1クロライドチャネルの機能解析はまだ行われていない。そこで，ラットアストロサイトグリア培養株であるC6細胞を用いてClC-1の機能解析を行った。その結果，5つのアイソフォームを同定し，そのうち1つだけが機能的に発現することを確認した。このグリア特異的アイソフォームは，膜電位ならびに細胞外クロライドイオン濃度に対する依存性が骨格筋ClC-1よりも弱い。またホールセル電流記録ではC6細胞にClC-1様電流が観察されないため，このアイソフォームは細胞内オルガネラで機能していることが予想された。またアストロサイト初代培養系では，さらに二つのアイソフォームが発現していることが示された。以上より，アストロサイトグリアでは，複数のClC-1アイソフォームが発現しており，細胞機能の制御に関与していると考えられる。本研究は次の論文に発表された(Xiao-dong Zhang, et al., 2004 GLIA 47: 46-57)。
清水貴浩，サビロブ ラブシャン，岡田泰伸
Frank Wehner (Max-Planck-Institute for Molecular Physiology, Dortmund, Germany)
高浸透圧性細胞収縮後の容積回復は調節性容積増加(RVI) と呼ばれ，細胞外からのNaClの流入によって成し遂げられる。HeLa細胞を用いた本研究において，高浸透圧刺激時に活性化するカチオンチャネルを見出したので，そのチャネルの電気生理学的性質とRVIにおける役割について検討した。この細胞収縮により活性化するチャネルは整流性や時間依存的なゲーティングを示さず，イオン透過性はNa+＞K+＞Cs+≫Ca2+であった。また薬理学的には，非選択性カチオンチャネル阻害剤であるGd3+，フルフェナミン酸，SKF96365に感受性があった。さらにこのチャネル阻害剤の細胞容積変化への影響を検討したところ，これら阻害剤の存在下ではRVI過程が抑制された。これらの結果から，高浸透圧性細胞収縮後のRVI過程にこの非選択性カチオンチャネルが関与していることが示唆された。本研究結果は次の論文に発表された(F. Wehner, T. Shimizu, R. Sabirov & Y. Okada 2003 FEBS Lett. 551: 20-24) 。
浦本裕美，高橋信之，A.K. Dutta，R.Z. Sabirov，岡田泰伸
赤塚結子（三重大学医学部・生理学第一講座）
森島 繁（福井医科大学医学部・薬理学講座）
CFTRは嚢胞性線維症の原因遺伝子の産物であることから，その研究の殆どは上皮細胞で行われている。心筋細胞にもCFTRが発現していることは以前から知られていたがその生理的，病態生理的意義については殆ど解明されていない。そこで私達は，最終的に虚血心室筋細胞でのCFTRの機能を探ることを目的とし，新生仔ラット心室筋から培養した細胞を用い虚血（グルコース除去・無酸素）のCFTR発現への影響を観察した。その結果，CFTRの形質膜への発現が虚血3時間でピークとなる一過性の亢進を示し，発現したCFTRはチャネルとして機能的であることが判明した。また，この発現亢進は転写後調節によることが明らかとなった。これら結果は次の論文に報告された(H. Uramoto, N. Takahashi, A.K. Dutta, R.Z. Sabirov, Y. Ando-Akatsuka, S. Morishima & Y. Okada 2003 Jpn. J. Physiol. 53: 357-365)。
図：虚血によるCFTRタンパク質の一過性の発現亢進；
A. 膜画分のwestern blot，B. northern blot。
（ ）内の数字はコントロールを100とした発現率を示している。
A.K. Dutta，R.Z. Sabirov，浦本裕美，岡田泰伸
虚血や低酸素条件下では心筋細胞や他の細胞からのATP放出により心臓の細胞間隙のATP濃度が上昇するがその放出機構は分かっていない。本研究では，新生仔ラット初代培養心筋細胞を用い，虚血及び低酸素刺激によるATP放出におけるATP透過性マキシアニオンチャネルの関与について調べた。虚血（薬剤による代謝阻害），低酸素刺激により細胞外にATPが放出され，その細胞表面の局所ATP濃度はマイクロモル濃度を越えた。また，これら刺激が誘導したチャネル活性は約390pSの単一チャネルコンダクタンスをもち，アニオン選択的で，ATP4-やMgATP2-にも透過性を示し，薬理学的性質はATP放出と一致した。以上の結果から，心筋細胞における虚血，低酸素刺激によるATP放出はマキシアニオンチャネルを介することが明らかとなった。これらの結果は次の論文に報告された(A.K. Dutta, R.Z. Sabirov, H. Uramoto & Y. Okada 2004 J. Physiol. 559: 799-812)。
