【概要】
感覚認知情報部門は視知覚および視覚認知の神経機構を研究対象としている。我々の視覚神経系は複雑な並列分散システムである。そこでは数多くの脳部位が異なる役割を果たしつつ，全体として統一のとれた視知覚を生じる精巧な仕組みがあると考えられる。また二次元の網膜像から世界の三次元構造を正しく理解できる仕組みもそなわっている。視知覚におけるこれらの問題を解明するために，大脳皮質を中心とするニューロンの刺激選択性や，異なる種類の刺激への反応の分布を調べている。具体的な課題として(1)初期視覚野における輪郭とその折れ曲がりの表現，(2)選択的注意による視覚および眼球運動関連領野ニューロン活動の変容，(3)大脳皮質における情報の補完の仕組み，などに関する研究を行った。
伊藤南，小松英彦
輪郭線の表現において折れ曲がりや分岐の表現は非常に重要な要素であるのにも関わらず，直線成分の表現のメカニズムくらべて折れ曲がり表現のメカニズムはあまりよく研究されていない。そこで，我々は注視課題遂行中のサルの第二次視覚野から細胞外記録を行い，十二方位からの組み合わせにより二本の直線成分をつなぎ合わせて作った輪郭線の折れ曲がりを受容野の中心に呈示して神経細胞の反応選択性を詳細に調べ，第二次視覚野には特定の組み合わせ（輪郭線の折れ曲がり）に対して特異的な反応選択性を示す細胞が多数存在することを見いだした。そのような選択性が形成されるメカニズムを明らかにするために，本年度も引き続いて，刺激中の半直線成分を単独で提示した際の反応をもとに，折れ曲がり刺激を構成する半直線成分に対する反応と折れ曲がり刺激に対する反応との関係を検討した。その結果，最適な半直線成分に対する方位選択的な興奮性の入力に加えて，不適当な半直線成分に対して働く方位選択的な抑制性の作用が選択性を決める上で重要な役割を果たしていることを見出した。また，特定方位への抑制性の欠如が見かけ上の最適な直線成分を生じるケースも存在した。この場合には最適な折れ曲がり刺激と最適な半直線成分との区別が困難であるが，第二次視覚野にはそのようなケースが多々見られた。以上の結果は第二次視覚野が輪郭線の折れ曲がりや分岐を検出する最初のステップであることを示唆する。
小川正，小松英彦
視覚探索では2つの注意機構が働いていると考えられている。一方は周囲と異なるポップアウト刺激によって受動的に引き起こされるボトムアップ性の注意過程であり，他方は知識や意思によって能動的に起動されるトップダウン性の注意過程である。視覚探索における2つの注意過程の役割分担が時間的にどのように変動しているかを明らかにするため，多次元視覚探索課題をサルに行わせてV4野と前頭眼野からニューロン活動を記録した。課題では2種類の色と形から成る刺激が注視点の周りに6個呈示され，その中には色及び形次元で異なる刺激が1つずつ（目標，妨害刺激）含まれる（例えば，1つの赤四角，1つの緑丸，4つの緑四角）。サルは色，または形次元で目立つ刺激に向かってサッカードを行うと報酬がもらえるが，どちらの次元で目立つ刺激を目標とするかは試行ブロックごとに切り替えられる。刺激呈示からサッカードが起動されるまでの期間のニューロン活動を解析した結果，ニューロン活動には2種類の情報が異なる時間領域で表現されていることが明らかになった。刺激呈示後の前半期間のニューロン活動では，主として受容野内の刺激がどの次元でポップアウトする刺激であるかの情報（ボトムアップ性注意）が表現されていた。これに対しサッカード直前の後半期間のニューロン活動では，主として受容野内の刺激が目標であるか否かの情報（トップダウン性注意）が表現されていた。
松本正幸，小松英彦
盲点の両側に2本の線分が同一直線上に呈示されると，盲点には網膜からの入力がないにも関わらず，一本のつながった線分が知覚される。このような補完知覚が生じるとき，サル大脳皮質一次視覚野(V1)で盲点に対応する視野を表現している領域（盲点表現領域）のニューロンが活動変化を示すことを既に見い出している。この実験では線分刺激を一方の眼の盲点付近の視野に呈示し，線分の一端を盲点外に固定したままもう一端を盲点の中心に向かって伸ばしていった時に，線分が盲点を突き抜けて補完が生じる時に非連続な活動の上昇を示すニューロンが見い出されている。この活動の上昇が補完の知覚とは無関係な文脈依存的修飾によって生じている可能性について検討した。そのために，非盲点条件において一方の眼の盲点に対応する視野の両側に一組の線分刺激を呈示し，片方は受容野内に呈示し，もう片方は受容野外に刺激を呈示するという条件でニューロンの反応を調べた。受容野内に呈示した線分刺激は反応を引き起こしたが，この反応は反対側に呈示された刺激によって修飾を受けなかった。この結果は，V1の盲点表現領域で線分の補完知覚が生じる時に観察されるニューロン活動の上昇が，補完知覚とは無関係な文脈依存的修飾では説明できないことを示している。
【概要】
液性情報研究部門では，これまで分子生物学的手法と生理学的手法を用いて，脳神経系における情報の伝達および統合のしくみを，分子・細胞のレベルから理解することを目的として研究を行ってきた。しかし近年の分子的情報の急激で莫大な増加に比較して，分子と個体を結びつける領域の研究が不十分であり，またその領域の研究がますます重要となって来ていることを考え，研究部門の方向性を変えてきた。現在の部門としての方向性は，主に電気生理学的な手法を用いてシステムの機能を総合的に理解することである。
2003年度は井上助手が着任し，ダイナミッククランプなどの新しい研究手法の開発に取りかかった。また非常勤研究員として伊藤英樹博士が加わり，不整脈疾患の原因となるナトリウムチャネル変異の解析を行うとともに，計算論的アプローチを取り入れた。計算論的アプローチは神経科学の領域にも必須のものとなってきており，計算論の応用が進んでいる心臓生理の分野に触れたことは，われわれのグループとして貴重な経験であった。
山肩葉子，小幡邦彦（理化学研究所）
Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII(CaMKII)は，中枢神経系に豊富に存在する蛋白質リン酸化酵素として，神経活動の制御やシナプス可塑性に深く関わっている。生体におけるCaMKIIの活性制御機構を明らかにするために，神経活動の活性化のモデルである急性けいれんを用いて，神経活動の一過性の上昇と回復後の脳ホモジネート中のCaMKIIの活性状態を検討した。その結果，けいれん中には，CaMKIIの活性化の指標となるThr-286(α)/287(β)の自己リン酸化が上昇するにも関わらず，キナーゼ活性が低下するという新たな形のCaMKIIが，界面活性剤に不溶性の画分で検出された。けいれんから回復すると，分単位の早い時間経過で，このようなCaMKIIはもはや検出できなくなった。このことは，CaMKIIの自己リン酸化が可逆的な不活性化を引き起こすという新たな活性調節機構の存在を示唆している。
山肩葉子，井本敬二
八木 健（大阪大学），小幡邦彦（理化学研究所），柳川右千夫（群馬大学）
Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII(CaMKII)の持つ三つの機能，(1)プロテインキナーゼ活性，(2)カルモジュリン結合能，(3)サブユニット同士の会合による多量体形成能，のうち，いずれが神経機能の調節に重要かを明らかにするためには，蛋白自体をなくす単純ノックアウトではなく，特異性の高い機能的ノックアウトマウスの作成と解析が必要であると考え，(1)のプロテインキナーゼ活性のみをなくした不活性型CaMKIIα(K42R)遺伝子改変マウスを，ノックインの手法を用いて作成した。このマウスでは，脳内におけるCaMKIIαの蛋白発現は保たれていたが，CaMKIIのプロテインキナーゼ活性のみが特異的に抑制されていた。現在，このマウスを用いて様々な脳機能の解析を行っている。
宮田 麻理子，井本 敬二
皮質―視床feedbackシナプスの伝達特性を明らかにするため，視床―皮質スライス標本を用いて，バレル皮質を刺激し視床VPL核投射神経細胞からEPSCを記録した。このEPSCは純粋なAMPA受容体の反応よりdecay time constantが遅く，薬理学的実験より15%あまりがkainate受容体によるEPSCの成分であることが分かった。また，代謝型グルタミン酸受容体一型のagonist存在下では膜電位は脱分極し，入力抵抗が大きくなることから，K channelが閉じることによる脱分極であることが明らかになり，今後，皮質―視床シナプスの特性をさらに詳しく解析する方針である。また，末梢から視床への脊髄視床路シナプスの入力と皮質視床シナプスの両方が同一の投射細胞から記録できるスライス標本を開発し，両シナプスの解析を行う予定である。特に，これら二つのシナプス伝達特性を詳細に解析し，シナプス特性を規定する分子を明らかにするとともに，お互いのシナプスの干渉作用つまり，どのようなタイミングで二つのシナプス入力が入ると，どのような出力になるかをシナプス可塑性も含めて解析したい。
佐竹伸一郎，井本敬二
小西史朗（三菱化学生命科学研究所）
Cyclin-dependent kinases (cdks)は，細胞分化・増殖の制御に関わるタンパク質リン酸化酵素として知られている。Cdkファミリーの一つcdk5は，成熟ニューロンの軸策や細胞体に強く発現することから，細胞周期の制御とは別の機能も担うと推定される。しかし，cdk5ノックアウトマウスは周産期致死のため，成熟ニューロンにおけるcdk5の役割は現在も明らかでない。シナプス機構におけるcdk5の機能を検索するため，小脳スライスでパッチクランプ記録を行い，cdk5特異的阻害薬roscovitineがシナプス伝達におよぼす作用を調べた。2週齢ラットから作成した小脳スライスにroscovitineを灌流投与すると，籠細胞-プルキンエ細胞間の抑制性シナプス伝達および平行線維-プルキンエ細胞間の興奮性シナプス伝達が顕著に増強した。一方，登上線維-プルキンエ細胞間の興奮性シナプス伝達にroscovitineは無効であった。薬理学実験や量子解析から，この阻害薬は，P/Q型カルシウムチャネルの機能を増強して，神経伝達物質の放出確率を増大させることが示唆された。また，roscovitineは，プルキンエ細胞から記録した抑制性シナプス後電流の減衰時定数(τ) や，tetrodotoxin非依存性の微小抑制性シナプス後電流の振幅を増大させた。したがって，cdk5は，抑制性シナプスを後シナプス性に制御する役割も併せ持つと考えられる。Cdk5は，シナプス種特異的かつ複数の機構により，小脳皮質のシナプス伝達制御に関わることが示唆された。
井上 剛，井本敬二
感覚情報は視床を介して大脳皮質へと運ばれる。しかし感覚信号が大脳皮質に至るまでに変換されていくその全プロセスを，単一細胞・シナプスレベルで解明した報告はこれまでほとんどない。この問題の解明に向け，私はまず感覚入力から視床神経細胞の“集団”へのシナプス配置構造を，電気生理学的手法を用いて明らかにした。単一の上行性興奮繊維は複数の視床リレー細胞へほとんど発散性の結合を持たなかったが，視床網様核細胞からの単一抑制繊維は複数のリレー細胞に幅広く発散性結合を形成していることを見出した。次に今回明らかにした神経回路構造の上で，どのような感覚信号変換が行われるのかを明らかにするため，ダイナミッククランプ法のシステムを立ち上げた。これは神経回路の一部を人工のものに置き換える手法であり，この手法を利用することによって従来の電気生理学的手法のみでは解明困難であった神経回路機能を明らかにできることが期待される。
伊藤英樹，井本敬二
清水賢巳，高田重男，馬渕宏（金沢大学医学部）
Brugada症候群は器質的心疾患認めないにもかかわらず，心電図異常（ST上昇など）を認め，心室細動，突然死を引き起こす。近年の遺伝子解析の結果，Brugada症候群の少なくとも一部は，心筋Naチャネルαサブユニットをコードする遺伝子SCN5Aの遺伝子変異が原因であることが知られている。
今回我々はピルジカイニドの投与にもかかわらずST上昇を認めなかったBrugada症候群に，今までに報告のない新変異(N406S)を見出し，その電気生理学的特徴をHEK293細胞を用いた発現系で解析した。
N406SはドメインIの膜貫通領域であるセグメント6に位置し，種を越えて保存されている領域の変異であった。活性化，不活性化の電位依存性はそれぞれ16 mV, 10 mV脱分極側へ偏移していた。N406Sは速い不活性化からの回復は有意に促進していたが，遅い不活性化からの回復は逆に遅延していた。Ruo-Rudyモデルを用いた心筋細胞シュミレーションでは，活性化の電位依存性の変化と遅い不活性化の亢進が本症例の病態に寄与していることが強く示唆された。ピルジカイニドによるtonic blockはN406Sにおいて変化を認めなかったが，使用頻度依存性は全く消失していた。一方，キニジンによる使用頻度依存性はむしろ亢進していた。
これらの結果から，本変異によるBrugada症候群は活性化の電位依存性の変化と遅い不活性化の亢進が原因であると考えられた。ピルジカイニドによる使用頻度依存性は本変異でほぼ完全に消失しており，provocation testの結果との因果関係を示唆した。一方キニジンに対する反応はむしろ亢進しており，ある特定の1種類のみによる抗不整脈薬を用いたprovocation testの結果の判定には注意を要することが示唆された。
佐々木幸恵，松下かおり，児玉貴史，井本敬二
脳の主要なCa2+チャネルサブタイプであるP/Q型Ca2+チャネル(CaV2.1) の遺伝子異常により，小脳変性症など神経疾患がヒト，マウスで起こる。マウスでは，tottering，rolling，leaner，rockerなどの変異が知られている。しかしCa2+チャネルの異常が，どのようにして種々の神経症状を引き起こすのかという疑問は解決されていないため，われわれは神経症状から考えて異常がありそうなシナプス部位を網羅的に検索してきた。今年度は特に小脳核，海馬，視床−大脳皮質投射に関しての検討を行った。
【概要】
本研究部門では哺乳動物の脳機能がどのような分子メカニズムにより形成，制御されているかを解明することを目的とし，脳構造形成および神経回路網形成に関わる遺伝子を欠損させたマウスの作製を行ってきた。
以前の研究で，Fyn遺伝子ノックアウトマウスを作製・解析した結果，同遺伝子が高次脳機能の制御に関わっていることを見いだした。そこでFynとの結合活性を指標に新規分子をスクリーニングしたところ，新規カドヘリン様細胞接着分子CNR (Cadherin-related neuronal receptor) /プロトカドヘリンαを単離する事が出来た。また他のグループの研究で，CNR遺伝子クラスターとよく似たゲノム構造と相同性を示す近縁分子，プロトカドヘリンβ，γファミリーが見いだされ，これらはCNRとともにさらに大きな遺伝子クラスター構造を取っていることが明らかになった。これまでの研究結果から同分子群はシナプスでの選択的細胞接着と多様化機構を有し，神経回路網形成に重要な役割を演じていることが示唆されている。そこでこれらの分子機能の解析により，神経細胞の多様化機構の分子メカニズムが明らかになるのではないかと考え，現在は同遺伝子欠損マウスの作製を中心に進めている。
平林敬浩，八木 健
CNR分子の機能を個体レベルで解析することを目的として，CNR遺伝子欠損マウスの作製を進めている。クラスター型遺伝子構造をもつCNR遺伝子には14個の可変領域エクソンと3つのエクソンからなる共通領域が存在し，各CNRファミリーはそれぞれひとつの可変領域エクソンと共通領域から転写される。本研究ではまず，全てのCNRファミリー遺伝子が欠損したマウスの作製を試みた。共通領域エクソンの上流または下流にloxP配列を導入したマウスをそれぞれ作製し，これらのマウスを交配させ共通領域の上流と下流にloxP配列を有するマウスを得た。これを組換え酵素Creを発現するトランスジェニックマウスとさらに交配させることで，共通領域を欠損したマウスを得ることができた。現在，このマウスの表現型について解析を進めている。また，1種のCNR分子のみを発現するマウスも同様に作製している。
金子涼輔，八木 健
マウスプロトカドヘリンはα型14種類，β型22種類，γ型22種類が18番染色体にクラスター構造を取って存在していることから，これらの協同性や機能分担に興味が持たれる。実際，当研究部門ではアルファ型とガンマ型の相互作用が膜移行に不可欠であることを明らかにしている。そこで，β型プロトカドヘリンの生理機能を明らかにする目的でその欠損マウスの作製を行った。β型プロトカドヘリンは22種類が約300kbにわたって存在しているため一度のターゲティングでは全欠損が不可能であることから，この両側にそれぞれloxP配列をノックインしたマウスを作製し，その後にCreリコンビナーゼによってβ型全領域を欠損させる計画を立てた。本年度は，loxPをノックインするターゲティングベクターを上流側，下流側それぞれ作製し，ES細胞へ導入した。上流側では相同組換えES細胞が得られていないのだが，下流側では相同組換えES細胞を取得し，そのキメラマウスも得られている。
牧野初音，八木 健
分化した神経細胞核における核内情報変換を解析することを目的として生後0-3日齢のマウス大脳皮質由来の神経細胞核クローンマウス胚からES細胞株の樹立を試みた。その結果，ES細胞株3株の樹立に成功した。得られたES細胞株にGFP遺伝子を導入し，正常マウス胚とのキメラマウス作製を試みたところ，ES細胞寄与率の高いキメラマウスは胎生致死，もしくは出生直後に死亡にする割合が高く，またES細胞の寄与率の高いE10.5キメラマウス胎仔では，分化した神経細胞核を用いたE10.5クローンマウス胎仔で観察されたものと同様の神経管閉鎖部における形態異常，および神経管構成細胞の異常が観察された。この結果は，分化した神経細胞核クローンマウス胚から樹立したES細胞株においても，神経細胞核の遺伝情報が維持，保存されることを示唆するものであり，今後は樹立したES細胞株を解析することにより，核内情報変換を解明したい。
多田基紀，八木 健
CNR(DrPcdh alpha)は神経細胞で発現するカドヘリン様受容体遺伝子群で，神経発生と維持に関わる。私はホールマウントin-situhybridization，免疫組織学を用いて，発生段階におけるゼブラフィッシュCNRの発現パターンを明らかにした。この結果，神経細胞の分化時期・領域と一致してCNRの発現が見られ，特に軸索にCNRタンパクが局在することが分かった。また，ゼブラフィッシュにおいて利用可能なことが知られているMorpholinoアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて，CNRタンパク質発現阻害を行うことでCNRの機能解析を行った。この結果，神経細胞分化の起こる領域にアポトーシスが観察され，かつaxonの伸長異常と，網膜視蓋経路の形成不全が見られ，神経発生，軸索形成時におけるCNRの関与が示唆されている。
