【概要】
形態情報解析室は，形態に関連する超高圧電子顕微鏡室（別棟）と組織培養標本室（本棟2F）から構成される。
超高圧電子顕微鏡室では，医学生物学用超高圧電子顕微鏡（H-1250M型；常用1,000kV）を，昭和57年3月に導入して同年11月よりこれを用いての共同利用実験が開始されている。平成15年度は共同利用実験計画が22年目に入った。本研究所の超高圧電顕の特徴を生かした応用研究の公募に対して全国から応募があり，平成15年度は最終的に11課題が採択され，その内10課題が実施された。これらは，厚い生物試料の立体観察と三次元解析，薄い試料の高分解能観察等である。共同利用実験の成果は，超高圧電子顕微鏡共同利用実験報告の章に詳述されている。超高圧電子顕微鏡室では，上記の共同利用実験計画を援助するとともに，これらの課題を支える各種装置の維持管理及び開発，医学生物学用超高圧電子顕微鏡に関連する各種基礎データの集積および電子顕微鏡画像処理解析法の開発に取り組んでいる。電子線トモグラフィーによる手法には，UCSD,NCMIRによる方法及びコロラド大で開発されたIMODプログラムでの方法を用いて解析を進めている。
本年度の超高圧電顕の利用状況の内訳は，共同利用実験等135日，修理調整等55日である（技術課脳機能計測センター形態情報解析室報告参照）。電顕フィルム等使用枚数は5,068枚，フィラメン点灯時間は417.8時間であった。装置は，平均71％の稼働率で利用されており，試料位置で10−６Pa台の高い真空度のもとに，各部の劣化に伴う修理改造を伴いながらも，高い解像度を保って安定に運転されている。
組織培養標本室では，通常用およびP2用の培養細胞専用の培養機器と，各種の光学顕微鏡標本の作製および観察用機器の整備に勤めている。
山口 登，古家 園子，有井 達夫
我々は高い電子線透過能と，5μmを越える生物試料でも4-5nmの解像力が期待できる1,000kV超高圧電子顕微鏡の特性を利用して，ラット小脳におけるプルキニエ細胞のゴルジ染色と免疫染色の三次元形態の比較を行っている。
3μmの切片について，−8度と＋8度でのステレオ写真を撮影し比較に用いた。ゴルジ染色の結果を1図に，免疫染色の結果を2図に示す。ゴルジ染色の場合には偶発的に染色されるが一旦染色されるとその細胞全体にわたって均等に染色されていることが分かる。免疫染色の場合には抗体の分布に依存して形状が細くなる場合などゴルジ染色に比較して細胞の形状を正確には反映しないことが分かる。しかし目的とする細胞を確実に同定できるので，コントラスト付加の方法をさらに工夫することにより，応用範囲はさらに拡大することが期待される。
図1．プルキニエ細胞: ゴルジ染色（±8°傾斜）
図2．プルキニエ細胞: 免疫染色（±8°傾斜）
古家園子，古家喜四夫（科学技術振興事業団，細胞力覚プロジェクト）
小腸絨毛上皮下線維芽細胞は消化管上皮の基底膜の下で細胞網を形成し，lamina propriaを包んでいる特殊な線維芽細胞である。この1つの細胞にタッチやストレッチの機械的刺激を与えると，ATPを放出し，細胞間を伝播するCa2+波を発生するとともに，細胞の収縮も波のように細胞間を伝播していく。絨毛上皮下線維芽細胞は血管や神経終末，絨毛の平滑筋とも隣接しており，絨毛におけるシグナル伝達の要の役割をはたしていると考えられる。
今回，小腸絨毛下線維芽細胞と神経細胞をco-cultureした。タッチ刺激により発生したCa2+波が小腸絨毛下線維芽細胞から神経細胞に伝播することが明らかになった。
小腸絨毛上皮下線維芽細胞は食物や水の摂取による機械刺激を感じるメカノセンサーであり，そのシグナルを知覚神経に伝達して摂食反射を引き起こしていると考えられる。
【概要】
随意運動や意志・判断などの高次機能を司る神経機構の研究が進められた。サルを検査対象として，大脳皮質フィールド電位の直接記録や陽電子断層撮影法などを併用して解析している。
逵本 徹
「意欲」や「意志」の神経機序は不明な点が多い。これまでに陽電子断層撮影法を用いた研究で，前頭前野・前帯状野・海馬の脳血流量が想定される意欲の変化と一致した変動を示すことを明らかにした。大脳辺縁系と前頭前野の「意欲」への関与を示唆する知見と考えられる。さらに一歩進めて，この脳領域でどのような神経活動が行われているのかを解明するために，運動課題を行うサルの前頭前野や前帯状野の大脳皮質フィールド電位を記録した。その結果，この部位のシータ波活動が「意欲」や「注意」に相関していると解釈可能な知見を得た。ヒトの脳波で「注意の集中」に関連して観察される前頭正中シータ波(Frontal midline theta rhythms)に相当するものと考えられる。両者の対応関係やサルのシータ波の発生状況をさらに詳しく研究中である。
【概要】
脳における情報処理には，ネットワークを構成する各ニューロンの発火パターンが意味を持つデジタル的過程と，非線形素子としてのニューロンの興奮性変化が意味をもつアナログ的過程の二つがあると考えられる。後者には種々の細胞内シグナル伝達系の活性が密接に関与しており，個々のニューロン機能の変化を通して，回路レベルで行われているデジタル的処理にも大きな影響を及ぼしている。それゆえ，特定のニューロン・ネットワークへの入力は同様であっても，ある条件のもとでは学習・記憶の生成・保持が起こり，別の場合には成熟・老化・細胞死が促進されるなど，多彩な結果が生じていると予想される。
当室では，外界からの刺激または侵襲に対する，受容体の変化−細胞内の分子の動き−生化学的変化−興奮性の変化−神経機能の変化−脳機能あるいは脳機能障害の発現，という一連の過程をニューロン・ネットワーク上で総合的に捉え，脳における情報処理の基本的な仕組みを理解することを目指している。現在は，中枢ニューロンの興奮性調節における細胞内シグナル伝達系の役割に注目し，脳スライス標本を用いて電気生理学的記録と光学的記録を併用した研究を行っている。
本年度は，総研大博士課程を修了した高木佐知子が特別協力研究員として，河村吉信（東京薬科大学生命科学部）と酒谷誠一（東京大学大学院新領域創生科学研究科）の両名が特別共同利用研究員として研究に参加した。昨年度に引き続き，狩野方伸（金沢大学大学院医学系研究科），酒井規雄（広島大学大学院医歯薬総合研究科）らと共同研究（生理学研究所一般共同研究）を行った。また，年度半ばよりNina Wettschureck（ハイデルベルグ大学薬理学研究所）と3量体Gタンパクを介するシグナル伝達の役割に関する共同研究を開始した。
坪川 宏
大脳皮質や海馬の錐体細胞では，細胞体側より樹状突起へ逆行性に伝播してくるNa+スパイクや，樹状突起局所的なNa+，Ca2+スパイクが，情報処理上の重要な役割を担っていることが示唆されている。これらの発生メカニズムと調節機構を明らかにするため，イオン・イメージングをはじめとした光学的手法と，パッチクランプ法等の電気生理学的手法を併用し，海馬スライス標本上のニューロンを用いて解析を行っている。
今年は，樹状突起局所的なCa2+スパイクの生理的条件下での発生要因について検討した。海馬スライス標本上にある錐体細胞の尖塔樹状突起よりパッチクランプ記録を行うとともに，Ca2+感受性蛍光色素を導入してCa2+イメージングを行った。放線状層に置かれた電極より電気刺激を加えると，興奮性シナプス後電位(EPSP)と逆行性に伝播されたNa+依存性活動電位が記録された。刺激頻度と強度を上げると，Ca2+スパイクを併発する場合があったが，細胞内Ca2+濃度の上昇は細胞のほぼ全域で見られた。一方，白帯・上昇層に置かれた電極で刺激を加えると，EPSPと逆行性活動電位の後にゆっくりした脱分極が見られ，しばしばNa+スパイクやCa2+スパイクが重畳した。逆行性活動電位の発生に伴う一過性の細胞内Ca2+濃度上昇は細胞のほぼ全域で見られ，樹状突起ではその後のCa2+スパイク時にもCa2+濃度上昇が認められた。この遅い応答は，アトロピン投与により消失したことから，ムスカリン性アセチルコリン受容体の活性化によるものと考えられた。樹状突起局所的なCa2+スパイクの発生は，生理的条件では，錐体細胞への主な興奮性入力と考えられるシャッファー側枝・交連線維からの入力だけでなく，アセチルコリン性の入力によるが必要であると考えられた。
坪川 宏
ニューロン機能における細胞内シグナル伝達の役割をより明確にして行くために，タンパク質リン酸化酵素をはじめとした酵素群の活性と種々のニューロン活動との時間的・空間的関係を解析することは必要不可欠と考えられる。本研究では，中枢ニューロンのモデルとして海馬スライス標本上の錐体細胞および小脳スライス標本上のプルキンエ細胞を用い，3量体Gタンパク質Gq及びG11のカスケードにつながるタンパク質リン酸化酵素，PKCの活性変化を可視化し，ニューロン活動やそれに伴う細胞内Ca2+濃度変化とPKCの活性変化との時間・空間的関係を明らかにすることを目指している。PKCの可視化のため，PKC結合性蛍光色素の細胞内導入や，GFP結合PKCを部位特異的に発現するトランスジェニック・マウスを用いている。
今年は，昨年に引き続き，小脳プルキンエ細胞にGFP結合γPKCを発現するトランスジェニック・マウスを用いて，PKCトランスロケーションの特性解析を行った。その結果，プルキンエ細胞の樹状突起では，平行線維からのシナプス入力によってトランスロケーションが樹状突起の幹を伝播するように順次起こってゆく様子がリアルタイムで捉えられた。この伝播は1) 代謝型グルタミン酸受容体の刺激により誘発され，2) 伝播速度は，4-10μm/秒で，タンパク質輸送の速度よりは早くカルシウム波よりは遅く，3) 一度伝播がおこると30分以上の不応期が生じるという性質を持っていた。
河村 吉信（東京薬科大学 生命科学部 生体高次機能学）
高木 佐知子， 坪川 宏
脳では，活動に伴って細胞容積の変化が起こっていると予想されており，動物の脳スライス標本を用いた研究では，近赤外光の組織透過率を解析した結果から，神経細胞やグリア細胞が神経活動依存的な容積変化を起こすことが示唆されている。我々は，海馬スライス標本を用いた透過光変化の解析から，高頻度刺激後に見られるCA1野錐体細胞の膨張には抑制性シナプス入力によるGABA受容体からのCl流入が関与していること，透過率の変化は細胞体層より樹状突起層において顕著であること等を報告した。そこで本年度は，海馬スライス標本上の神経細胞においてシナプス入力による容積変化を単一細胞レベルで解析し，細胞種による差があるかどうか明らかにすると共に，この容積変化がシナプス伝達に対して調節因子として働いているかどうか明らかにすることを目標とし，以下二つの解析を進めた。
1. 単一海馬CA1錐体細胞の容積変化の検出
スライス標本上の神経細胞を予め蛍光色素で染色しておき，二光子レーザー蛍光顕微鏡を用いて，海馬CA1領域の単一の錐体細胞の断層撮像を行った。この蛍光画像を基に細胞の立体構築を行い，透過光変化の解析より得られた測定条件を参考に，求心性線維の電気刺激時にそれぞれの細胞で容積がどのように変化するか解析した。また，対象実験として，細胞外液の浸透圧を変化させた前後の錐体細胞の容積変化を解析した。細胞外液の浸透圧を低下させたときの細胞容積は，細胞体から近位樹上突起にかけて均一に増加することが確認できた。しかしながら，求心性線維の電気刺激に対しては細胞容積の優位な増加は確認できなかった。シナプス活動に伴う透過光変化は，薬物によりグリア細胞の活動を選択的に抑制してもほとんど差がないことが確認されているので，透過光変化の主な要因は神経細胞によると考えている。今回，2光子レーザー蛍光顕微鏡を用いた断層撮像による容積変化の観察で，シナプス活動依存的な容積変化が見られなかった理由としては，容積を測定した錐体細胞が，比較的スライス表層にあるものに限定されており，実際に細胞の膨張に必要となる興奮性と抑制性の適切なシナプス入力を受けていなかった可能性が挙げられる。今後は，同時にシナプス応答の測定をする必要があると思われる。
2. 神経細胞の容積変化とシナプス伝達との関係の解析
細胞容積変化がシナプス伝達に及ぼす影響を，CA1野錐体細胞のシナプス応答をモデルとして解析した。細胞外液の浸透圧を減少させ，細胞の膨張を促したときのシナプス応答の変化を確認するため，ホールセルパッチクランプ法を用いて，任意のCA1野錐体細胞から興奮性シナプス後電流を記録した。また，蛍光色素を細胞内に注入し，細胞容積変化を蛍光強度の変化として捕らえ，シナプス後電流の測定と同時にその変化を観察した。低調液によって細胞膨張を促したところ，膨張に伴う蛍光強度の低下と，これに伴う興奮性シナプス後電流の増強が見られた。今後は，細胞膨張と抑制性シナプス応答変化の解析，さらに，この細胞膨張に伴うシナプス活動の変化のメカニズムの解明が必要であると考えている。
酒谷 誠一（東京大学大学院 新領域創成科学研究科 基盤情報学）
毛利 達磨（生理研 細胞内代謝），坪川 宏
神経細胞の活動電位は，細胞膜の導電性を変えることにより，その電位を瞬間的に変化することで生み出される。しかしながら，活動電位を形成するべく流入したナトリウムイオンの細胞内動態や，電位発生の際に生じる細胞内の微視的な電位勾配が細胞内にもともと存在したナトリウムイオンの動きにどのように影響を与えるか等はいまだ明らかではない。そこで，本研究では，細胞内ナトリウムイオン濃度の時間変化を観測することにより，まず神経細胞を脱分極させたときに細胞内ナトリウムイオンがどのような挙動を示すか解析した。
海馬錐体細胞にナトリウムイオン感受性色素(Sodium Green, Molecular Probes)を注入し，高速撮像の可能な共焦点顕微鏡を用いて，細胞体における色素蛍光強度の時空間分布の画像を取得した。得られた画像データに統計処理を施して，ナトリウムイオンの場所ごとの濃度変化量，およびその立ち上がり時間に着目して計測した。その結果，SN比が十分ではないものの，活動電位発生時に一致して膜直下（1μm以内）でナトリウムイオン濃度が顕著に立ち上がる様子が，多くの例で観測された。一方，細胞中心部では，立ち上がり時間が活動電位発生から約1秒後と極端に遅いことが観測され，これはナトリウムイオンの単純な拡散による遅れと一致することが示された。
細胞内ナトリウムイオンは，脱分極によって細胞内に流入し，濃度勾配に従い細胞膜近傍から細胞中心方向に移動する。細胞内では電位が均一であるため，電位勾配がなく，膜電位の影響も受けない。すなわち，細胞体領域において膜電位がイオンの挙動に影響を与えるのは，イオンチャネル近傍においてのみであると考えられた。
【概要】
脳機能に代表されるような複雑な生物反応機構の解明に，分子生物学的技術と発生工学的技術を駆使した遺伝子転換動物の作製は必要不可欠である。とくにラットの遺伝子ターゲッティング技術の開発は，脳神経系遺伝子を含む数万にも及ぶ遺伝子の役割を研究するために重要であり，切望されている。脳機能分子解析室では，遺伝子改変動物（マウス，ラット）の作製を進めるとともに，遺伝子ターゲッティングによってノックアウトラットを作製することを究極の目的としている。これまでに，ES細胞，始原生殖細胞，神経幹細胞，造血幹細胞，精原細胞の細胞株樹立を目指した研究を行うとともに，核移植や顕微授精など，ラットにおける発生工学的技術の高度化に取り組んできた。研究課題のうち下記の2題を具体的に示す。(1)ラット未分化細胞株を樹立するため，全身にテロメレースを高発現するトランスジェニックラットの作製を行った。(2)円形精子細胞の顕微注入によって効率的にラット産仔を作出するため，卵母細胞の活性化誘起方法について検討した。
平林 真澄，金子 涼輔
TERTを強制発現させれば細胞が増殖停止状態に陥らず，不死化することが知られている。そこで，ラット未分化細胞株を樹立するためのrTERT-Tgラットの作製を試みた。cDNAを全身に強発現させるCAGプロモーターの下流にrTERT cDNAとtauGFP cDNAをires配列を挟んで導入した発現ユニット(CAG-rTERT-ires-tauGFP)を構築し，ラット前核期卵に顕微注入した。生存卵子323個を移植したところ計49匹( 15% ) の産仔が得られ，うち4匹( 8% ) がTgラットだった。最初に生まれたTgラットではRT-PCR法で精巣と大脳皮質にGFP発現が確認され，8コピーのトランスジーンがゲノム上に組み込まれていた。この系統についてはトランスジーンのホモ化を進めている。またこれら4系統からG1ラットを作製し，主要臓器を中心に遺伝子発現を確認していく予定である。
平林 真澄，保地 眞一（信州大）
塩化ストロンチウム(Sr2+)で活性化したラット卵母細胞に円形精子細胞をROSIすることで個体作出できるが，その産仔率は1.4%と低かった。そこでラットROSIの成功率を改善するために，卵母細胞の活性化方法について検討した。雌ラットから採取した未受精卵子を1.25 mMのSr2+で20分間（Sr2+区），または100V/mm，99 msec，2回の直流パルス後に2 mM 6-DMAPで20分間処理（DC+ DMAP区）し，活性化を誘起した。そして雄ラットの精細管から調製した円形精子細胞をROSIし，偽妊娠雌ラットに移植して産仔への発生率を調べた。Sr2+区とDC+DMAP区の間でROSI後の生存率，二前核形成率，分割率に有意な差は認められず，産仔率もそれぞれ，6.5%と7.8%で同等だった。以上，ROSIに先だって行うラット卵母細胞の活性化誘起処理には，Sr2+法とDC+DMAP法のいずれもが有効だった。
