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実習コース紹介

 in vitro 発現系を用いたイオンチャネル・受容体の機能解析

 組織からの蛋白質複合体精製と質量分析による蛋白質同定

 免疫電子顕微鏡法

 ジーンターゲティングマウス作製の基礎から応用へ

 パッチクランプ法

 スライスパッチクランプ法

 スライスおよびin vivoブラインドパッチクランプ法

 ゼブラフィッシュを用いた神経回路機能の解析

 麻酔下動物での急性電気生理実験

 慢性動物実験法入門

 ポリアクリルアミドゲル中の目的タンパク質に修飾されている糖鎖の解析

 脳磁図によるヒト脳機能研究の基礎

 ヒト脳機能マッピングにおけるデータ解析入門

 生理学実験のための電気回路・機械工作・プログラミング(1)
 (生体アンプとバスチェンバーの作製)

 生理学実験のための電気回路・機械工作・プログラミング(2)
 (C言語によるPICプログラミング)

 超高圧電顕トモグラフィー

1. in vitro 発現系を用いたイオンチャネル・受容体の機能解析

神経機能素子研究部門

イオンチャネル・チャネル型受容体・代謝型受容体等の膜機能蛋白を、アフリカツメガエル卵母細胞、HEK293細胞等のin vitro発現系を用いて発現させ、その分子機能と細胞応答を、2本刺し膜電位固定法、パッチクランプ法、細胞内Ca2+ イメージング法、FRET法に基づいた分子プローブによるcAMP解析法などにより記録するトレーニングを行う。データの解析法や実験の統合的な進め方についてのトレーニングも行う。少人数制とし、マンツーマンに近い形での指導を行う。電気生理学の初心者、分子生物学の初心者も歓迎し、各自の希望に沿えるよう、可能な範囲で個別対応も行う。

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2. 組織からの蛋白質複合体精製と質量分析による蛋白質同定

生体膜研究部門

脳の複雑かつ精緻な活動を支える脳細胞(神経細胞・グリア細胞)の働きは、個々の細胞が保有する多種の蛋白質の機能によって成立します。イオンチャネルや受容体、シグナル分子、酵素などの機能蛋白質は、適材適所で互いに相互作用し蛋白質複合体を形成して、ユニットとして機能します。したがって、これら蛋白質相互作用を生化学的に同定することは、脳機能を理解する上で必須です。本コースでは、免疫沈降法により、脳組織から特定の蛋白質を含む蛋白質複合体を精製し、質量分析装置を用いて、複合体構成分子を同定するまでを実習します。生化学実験の経験は必須ではありませんが、精製から同定までほとんどの実験操作を実際に受講者自身に行っていただきます。短期間集中的に行いますので、若干ハードワークなコースとなります。

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3. 免疫電子顕微鏡法

脳形態解析研究部門

生体のはたらきを知るためには、まずその構造を知り、機能分子がその構造の中でいかなる分布、局在、動態を示すかを知ることが、基本的に重要である。電子 顕微鏡レベルで分子の局在を可視化するためには、特定の分子を選択的に、且つできるだけ高解像度で標識することが必要となる。免疫電子顕微鏡法(免疫電顕法)とは、超微形態レベルで抗原分子の局在を特異抗体を用いて観察する免疫組織化学法のことである。本コースでは神経科学において高解像度で抗原分子の局在を観察するために広く使われているPre-embedding法やPost-embedding法などの金標識抗体法に加え生理学研究所脳形態解析研究部門で最近行っている凍結割断レプリカ免疫標識法を紹介する。具体例として、神経伝達物質受容体の局在解析をとりあげるが、受講者が希望すれば任意の分子について実験を行うことも可能である。

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4. ジーンターゲティングマウス作製の基礎から応用へ

遺伝子改変動物作製室

マウスでは、生殖細胞への分化能を持ったES細胞レベルで、標的遺伝子組み換えを施し、その組み換えES細胞を受精卵へインジェクションすることで、標的遺伝子の配列を自由自在に改変させた個体を作り出すことができる。分子生物学的手法と発生工学的手法を駆使して作製するこの手法は、マウスにおけるジーンターゲティング法と呼ばれており、ヒト疾患の発症メカニズムや脳神経機能の分子メカニズムを解明するのに大いに役立っている。本コースでは、マウスにおける、1) ES細胞培養の基礎、2) 実験動物の取り扱い、3) 受精卵の採取(過剰排卵誘起、卵管・子宮灌流)、4) 受精卵の顕微操作(8-cellインジェクション)、5) 胚移植(胚の子宮内移植)といった発生工学の基本技術について実習する。

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5. パッチクランプ法

細胞生理研究部門
生体恒常機能発達機構研究部門
機能協関研究部門

パッチクランプ法による実際の電流記録と活動電位の関連を基礎から学ぶことができます。全細胞記録法を用いて神経細胞上で実際に発生する活動電位を記録し、その背景にある膜電位依存性Na+及びK+イオンチャネルの活動を膜電位固定下で記録します。それらの実際の膜電位依存性を電流・電圧曲線を描いて分析することにより、活動電位の発生機構を理解します。こうした基本法を修得した後、希望者は以下のような応用技術を学ぶことができます。
1) 基本法をもっと進めて電位作動性チャネルの単一チャネル電流記録等を行います。
2) 細胞内情報伝達関連分子をintactに保ったまま、イオンチャネルなどの各種細胞センサー活動を観察できる穿孔パッチ法の技術/応用を修得します。具体的には、アンホテリシンB穿孔法を利用した受容体-イオンチャネルの細胞内クロストーク、およびグラミシジン法を利用した神経細胞本来のGABA応答や細胞内Cl-濃度調節機構を観察する技術/応用を習得します。また、神経細胞を急性単離する技術やYーチューブによる急速薬液投与法の修得も可能です。
3) 非選択性陽イオンチャネルで高いCa2+透過性を有する温度感受性TRPチャネルの機能解析を学びます。具体的には、培養感覚神経細胞や温度感受性TRPチャネルを強制発現させたHEK293細胞を用いて温度変化による電流活性化をパッチクランプ法によって観察します。温度と電流情報を同時に取り込み、電流の温度依存曲線を作成します。

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6-1. スライスパッチクランプ法

神経シグナル
大脳神経回路論

パッチクランプ実験の初心者を主な対象として、脳スライス標本の作製手順、細胞の選別法、ホールセル記録の基本的手技を指導する。本コースは、パッチクランプ実験の原理を理解するとともに、スライスパッチクランプ法を各自の研究目的に即して実際に適用できるようになることを目標とする。実習では、マウスやラットの脳スライス標本(大脳皮質・小脳・海馬など)を作製し、current clamp法ならびにvoltage clamp法を用いてニューロンの発火活動やシナプス電流を記録する。また、データの解析方法についても概説する。希望者には、記録した細胞を可視化して形態を観察する方法(バイオサイチン染色法)も併せて指導する。染色法の受講希望者は、オンライン申し込みフォームの備考欄に「バイオサイチン染色法受講希望」と明記してください。

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6-2. スライスおよびin vivoブラインドパッチクランプ法

神経シグナル

本コースに用いるブラインドホールセルパッチクランプ法は、細胞を視認する必要がないために高価な顕微鏡が不要であり設備投資が低く抑えられること、また、組織表面のみならず深部に位置する神経核やミエリンが発達し可視化が困難な成熟した動物、作製に日数を要するモデル動物を対象にできるなどの長所を有す。脊髄後角や脳幹青斑核のスライス標本を用いて記録の実習を行い、感覚伝達、特に痛みをテーマとしてカプサイシンなどTRP受容体作動薬のシナプス前性の作用解析、また、希望者にはin vivoパッチクランプ法を用いた感覚シナプス応答記録の実習も行う。ブラインドパッチクランプ記録法と統合的な感覚伝達機構解析法の習得を目的とする。

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7. ゼブラフィッシュを用いた神経回路機能の解析

神経分化研究部門

ゼブラフィッシュは、胚期、幼期を通して体がほとんど透明であり、蛍光タンパク質を用いて神経細胞を生きたまま高精度に可視化できる。本トレーニングコースでは、この長所を実際に受講者にふれてもらうことを第一義の目的として以下の実験を行う。
(1) DNAコンストラクトの胚への注入と、GFP発現細胞の観察:
当方で用意したDNAコンストラクトを一細胞期の胚に注入する。DNAコンストラクトとしては、GFPだけでなく、ChR2(下記参照)も用いる。1―3日後に、ラベルされた神経細胞の形態を共焦点顕微鏡で観察する。
(2) カルシウムイメージング:
遺伝学的にコードされたカルシウムインディケーターG-CaMPを脊髄神経細胞へ発現させ、幼魚の行動に伴う神経活動をカルシウムイメージングによってモニターする。
(3) 幼魚の神経細胞からの電気生理学的記録:
GFP、および、ChR2でラベルされた脊髄神経細胞からの、仮想遊泳行動中の電気生理学的な記録を紹介する(講師によって行われる)。また、ChR2(光によって活性化する陽イオンチャネル)発現細胞においての、光によるスパイク誘発を確認する。

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8. 麻酔下動物での急性電気生理実験

認知行動発達機構研究部門

麻酔下の動物で神経回路を構成する細胞間の結合関係や神経回路の動的特性、また個々のニューロンの細胞内電位や膜特性を計測する実験は1950年代から微小電極法の開発に伴って急速に進歩し、1960-70年代までは神経生理学における主要な実験技術のひとつとされ、その過程で様々なノウハウが蓄積されてきた。しかし1970年代から無麻酔動物での行動中の神経活動の記録法が発展してきたこと、また単離培養細胞やスライスなどのin vitroでのパッチクランプ法などの実験系がより洗練されてきたこと、さらには機能的MRIなど非侵襲的脳機能イメージング法が発展してくるに従って、麻酔下の動物での電気生理実験は「辛くて大変な割にはあまり大したことがわからない実験」として敬遠され、すっかり下火になってしまっていた感があった。しかし、近年遺伝子改変動物の開発技術が発展し、分子生物学が個体の機能の解明を目指すようになってきたこと、さらには培養細胞やスライスで解析できることの限界が認識されるに従って、条件を制御した状態で個体機能を解析できる麻酔下個体動物での急性電気生理学的実験の有用性が再認識されるようになってきている。本コースでは麻酔下動物での電気生理実験の最も基本的な実験手技を習得することを目的として、麻酔下ラットにおいて視覚および体性感覚刺激に対する大脳皮質感覚野と中脳上丘におけるフィールド電位や単一ニューロンの応答を記録する手法を実習する。特に麻酔下で動物の全身状態を良好に保つことが実験を成功させる秘訣である。様々な生体機能の指標に注意を払いながらより良い実験データを取得する方法を学ぶ。

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9. 慢性動物実験法入門

生体システム研究部門

覚醒下の実験動物に様々な課題を遂行させ、その際の神経活動を記録・解析するという「慢性実験」は、神経回路が実際に生体内でどのように働いているのかを解明する強力な手段です。慢性実験は主に霊長類を用いた実験手技として発達・洗練されてきたのですが、げっ歯類にも応用可能で、とくに遺伝子改変動物を用いたin vivo記録は、物質と行動との間をつなぐ重要なステップです。また、慢性実験は覚醒下で行うため、麻酔の影響を排除することや、繰り返し同一の実験動物を使うことが可能です。さらに従来の急性実験の手法を用い、様々な脳領域に刺激電極を留置し電気生理学的に神経回路を解析することや、脳局所への薬物注入による行動変化なども観察することができます。しかし、このような実験技術は各研究室で手から手へと受け継がれることが多く、なかなか体系だって習得する機会が少ないのが現状です。本コースでは、このような慢性実験を始めたばかり、あるいはこれから始めようとする研究者や大学院生を対象に、実験動物からの神経活動記録、金属電極作成、実験に必要なハードウエアやソフトウエアなど、基本的な技術習得を目指して実習を行います。

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10. ポリアクリルアミドゲル中の目的タンパク質に修飾されている糖鎖の解析

分子神経生理研究部門

プロテオミクス全盛期にあり、タンパク質の翻訳後修飾の解析が重要視されている。その中でも、糖鎖修飾についてはその種類の多さや不均一性、構造の複雑な分岐性などからリン酸化修飾ほど盛んに解析されていない。しかし、糖鎖は細胞表面の大部分を覆い、細胞間や細胞-基質間相互作用に重要な役割を果たしていることが知られている。細胞表面上に存在する殆ど全ての膜タンパク質が糖鎖修飾されていると考えられており、脳形成などにおいても糖鎖の重要性が明らかになりつつある。本コースでは、目的タンパク質に付加されたN-結合型糖鎖の精製法および解析法をトレーニングする。SDS-PAGE後に目的の糖タンパク質を切り出し、そこから糖鎖を簡便に精製する。高額な装置などを用いず、簡単にできる精製方法を実習する。糖鎖解析にはHPLCを用いる。受講者が希望すれば、希望する特定タンパク質の糖鎖解析を行うことも可能である。初心者も歓迎する。

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11. 脳磁図によるヒト脳機能研究の基礎

感覚運動調節研究部門

初日午前は、脳磁図の原理や測定方法などの基本的事項を講義、実習にあたっての注意事項を確認する。午後から三日目にかけて、体性感覚、聴覚、視覚のそれぞれの分野について、実際に脳磁図の実験を行う。参加者は、脳磁図データの測定や被験者を体験する。実際に測定したデータを用いて、種々の解析を行う。最終日の金曜日は、参加者が希望する実験を行う。これにより、脳磁図に向く実験やパラダイムについての理解を深める。以下にそれぞれの分野の概略を述べる。体性感覚:手(正中神経)および足(後頸骨神経)の刺激による最初の大脳活動(中心後回の3b野)を記録する。体部位再現に矛盾のない部位に活動がみられるか、手と足の刺激で反応潜時に差があるかなどを検討する。聴覚:ヒトが音を聴取した際に記録される脳磁場反応の発生源や刺激音の周波数情報に依存する聴覚野の局在を確認することを目的する。視覚:視覚実験では、特に研究対象となる機能的部位により刺激の選択が大変重要となる。今回の実習では、比較的簡単な刺激から高次視覚情報処理を観察するための特殊な刺激まで、いくつかの刺激を紹介しながら、実際に記録される波形を分析しその結果について検討していきたい。

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12. ヒト脳機能マッピングにおけるデータ解析入門

心理生理学研究部門

機能的磁気共鳴画像法(functional MRI)に代表される脳機能画像法の発達により、人体を傷つけることなく脳活動を可視化出来るようになった。得られたデータの解析には画像処理や統計学的手法の応用が不可欠であるが、SPMを代表とする解析パッケージが容易に手に入ることもあり、その中身を理解しなくとも簡単に結果が得られる状況にある。データ処理手法は近年ますます高度化・複雑化し、初学者が独学で理解するには難しい面もあるが、誤った取扱い(安直な実験課題作成や不適切な解析、誤った解釈など)は、真実からかけ離れた結論を導き出しかねず、注意が必要である。本コースは、脳機能画像解析の初級編と位置づけ、主に画像データの前処理および統計解析(個人解析・集団解析)の理論と実際について、機能的MRIデータを教材とした講義と実習を行う(MRIを使った撮像実習は行わない)。これらを通して脳機能画像法のもつ可能性とピットホールについてバランスのとれた理解を深められるようにする。SPMを作動させるにはMathworks社製のソフトウェアであるMATLABが必須である。受講に当たってはspm8が作動するMatlab 7.1 (R14SP3) か、それより新しいバージョンをインストールしたノートパソコンを持参することが必須である(ネットワークライセンスは不可)。

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13-1. 生理学実験のための電気回路・機械工作・プログラミング(1)

生体アンプとバスチェンバーの作製

技術課

本実習コースは、電気回路工作・機械工作実習を通して研究を進める上での「も の作り」の大切さを知ることを目的としています。電気回路工作では、生体アンプの作製を通して回路設計の基本、回路図の読み方、はんだ付け技術の習得を目指します。また生体信号の計測をLabVIEWを用いて体験し、計測・制御の理解を深めます。機械工作では、アクリル製バスチェンバーの作製を通して機械設計のポイント、材料の選択、加工手順、縦フライス、旋盤、ボール盤等の工作機械の使用法を習得します。本実習コースは、一人の方が最初から完成まですべて行う、より実践型の実習であることを特長としています。

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13-2. 生理学実験のための電気回路・機械工作・プログラミング(2)

C言語によるPICプログラミング

技術課

種々の実験の制御や計測に応用可能なPIC(Peripheral Interface Controller)を取り上げ,PICを応用するためのハードウェアとソフトウェアの基礎を学びます。ハードウェア実習ではPIC本体の構成と機能ならびに周辺部品の概要を学び,「PICマイコン学習キット」の作製を行います。ソフトウェア実習では,C言語のプログラミングの基礎を学習し,PICを制御するためのプログラムを作成します。作成したプログラムは,PICライタにて書き込みを行い,先に作製した「PICマイコン学習キット」を使って動作確認を行います。このような実践型の実習を通し,生理学実験に必要となる実験機器の製作技術の基本と応用力の養成を目的とします。

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14. 超高圧電顕トモグラフィー

形態情報解析室/電子顕微鏡室

電顕トモグラフィーは、試料を連続的に傾斜させて電顕像を収集し、投影像からそこに含まれる三次元構造を再構築する方法である。本コースでは、生理研の共同利用機器である超高圧電子顕微鏡H-1250M(1000kV)を使って、1ミクロン程度の厚い生物試料の三次元再構築を行う。4日間のコースでは、1)厚切り試料の作製、2)傾斜像の収集、3)立体再構成、4)構造のセグメンテーション、を実習する。試料は、参加者が持参したもの(樹脂に包埋した状態のもの)を用いることもできる。トモグラフィー解析には、フリーのソフトウエアを使用し、基本的に各自で持参のラップトップコンピュータを使って行う。コース期間中に、参加者どうしの研究紹介を行い、研究交流を深める。

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