Oocyteは、外側の血管および結合組織からなるfollicle membraneと、その内側の硬い透明な細胞外器質であるvitelline
membraneの、2種類の膜により覆われています。微小電極法で記録するには、外側のfollicle membraneを除去する必要があり、patch
clamp法を適用するには、さらに、vitelline membraneを除去する必要があります。follicle
membraneを除く方法としては、Collagenaseで化学的に消化して単離する方法と、先の細いピンセット（ビガーとかデュモン社など No.5）で剥ぐ方法があります。前者は、大量のoocyteを得るのに適していますが、腹のバッチごとに酵素が効きすぎると細胞にダメージが大きくなり、良い細胞を選別して用いる必要があります。後者は、細胞への侵襲は少ないものの、一度にたくさんの細胞の処理が困難です。複数の実験者が一度に実験する場合、前者は効率が良く、生化学的解析にも適しています。
用意するもの○培養液 ND96+
○組成
○96 mM NaCl
○2 mM KCl
○1.8 mM CaCl2
○1 mM MgCl2
○5 mM HEPES, pH7.5 with NaOH,
○80 microgram/ml Penicillin G (Sigma)
○100 microgram/ml Streptomycin (Sigma)
○Sodium pyruvate 550 mg/liter)（Wako）
無機塩とHEPESを含む10x ND96溶液を作りオートクレーブしておいて室温で保存する。また、PenicillinGとStreptomycin、Sodium pyruvateはfilter滅菌した高濃度溶液を用意しておく。
ND96+を作るときには、10x ND96を、滅菌蒸留水で薄め、これにPenicillinG,Streptomycin, sodium pyruvateを加えて作る。
○酵素 Collagenase S-1 （新田ゼラチン 株式会社生物化学研究所）○麻酔薬 3-AminobenzoicAcid Ethl Ester (Sigma, #A5040)
○酵素処理用Ca-free溶液
（OR2-Ca-free）組成（82.5 mM NaCl, 2mM KCl, 1mM MgCl2, 5 mM HEPES, pH 7.5, with NaOH）
ND96の時と同様、10x OR2 Ca(-)溶液を作っておき、滅菌蒸留水で薄めて1xを作って、使う。
○手術道具一式パスツールピペット（オートクレーブ済み。先端をアンプルカッターなどで折り、バーナーで丸くしておく。小さめから大き目の物と二種類を用意しておく。1回使用したものでも、アルコールにつけて保存しておけば、再利用可能）
手術道具―はさみ（またはメス）、ピンセット二つ（70%エタノールで拭いて置く）、小動物用ナイロン糸、針
ファルコン50 mm径プラスチックシャーレ
50 mlコニカルチューブ
カエルの麻酔処理カエルは麻酔下で手術を行う。
１）4リットル程度の大きさのバケツかビーカーに1リットルの蒸留水を入れ、2g/Lの3-AminobenzoicAcid Ethl Esterを溶かす。（すぐ解けるが、一応水をふって完全にとかす）
２）大き目の発泡スチロールの箱に氷をいれ、これに上のバケツを乗せて、冷やしておく。（または、麻酔薬を溶かしたバケツを冷蔵庫かコールドルームに入れて、冷やしておく）
カエルをいれる。ふたをしておく（カエルは、ひとがいないところで簡単に外へ逃げる）。30分程度で麻酔がかかる。ひっくり返してみて、起き上がらなければ、大丈夫。
平らな皿に氷を敷き、その上にカエルを仰向きに置く。乾燥しすぎたり、冷たすぎると、皮膚を損傷するので、ときどき、ミリQ水をかける。
卵母細胞の採取カエルが眠ったのを確認したら腹部を切開して卵母細胞を採り出す。
３）ハサミまたはメスを用いて、カエル腹部の皮膚、正中線から外側へ1/2程度の箇所に、1cm程度の切開を入れる（外側に向かって前に45度程度の角度になるような感じ。カエルにヘソはないのだが、仮想的な「ヘソ」のあたりから斜め上方向）。筋膜が見えるので、小型のハサミで奥の臓器を傷つけないように1cm程度切る。筋が切れると奥に黒い組織（卵巣）が見える。隙間からピンセットで引っ張りovary
lobeをとりだす。ピンセット二つを使い、まず一つで一端をつかみ、すこし引っ張り出す。ちぎれそうなら、べつの方向に引っ張る。これを繰り返すとちぎれずに取り出せる。無理に引っ張ると卵巣が崩れてしまうので、だましだまし色々な角度に引いてみる。適当な大きさが出たら、ハサミで切り取り、ND96の入ったシャーレへ移す。以前のオペのあとは避ける。（右側に傷があれば、左側をオペする）残った卵巣は、ピンセットの先で、腹部を傷つけないようにして戻し込む。
縫合処理カエルの腹を縫合して水槽に戻す。
４）筋層、皮膚をそれぞれ3針ずつ程度縫う。
バケツの麻酔薬の入った水を、あたらしい水に交換しカエルを水に戻す。10分程度したら、覚醒するので、カエルを水槽に戻す。手術したカエルは、弱っていると同時に、卵巣の再生には時間がかかる（数ヶ月程度）ので、リカバリー水槽として区別した水槽へ入れて飼育する（オペを行なった日時を記載しておき、決まった時期まで封印する）。
卵は黒と白がはっきり分かれており、黒い部分がはがれていないほうが良い。以前手術してあると、卵が体壁に癒着していたりして、その場合には卵はよくないことが多い。
この時点で卵の調子がよくないようなら、もう1匹さばく。（我々のっ研究室では、2匹を並行してさばくことを心がけている。Oocyteでの実験はバッチの良さによることが多く、腹がわるいと全く発現が見られない場合すらある。もともとの悪いカエルが同定できれば良いが、実験をするまで（記録をとるまで）見かけだけではわからないことがある。）
卵母細胞をほぐす採り出した卵を酵素処理によってバラバラにする。
５）Collagenase S-1をOR2-Ca-free溶液に溶かす。1mg/mlの濃度になるように。50 mlのコニカルチューブに約25 ｍｌずつ、二つ用意する（計50 ml）。容量は、単離したovary lobeのサイズによって変える。
６）ピンセット二つを用いて、卵巣の一番外側にある結合組織をほぐす。卵巣は袋状になっていていわば葡萄の房状態である。ただし、葡萄と違って、卵は、茎についているのではなく、一番外側の結合組織（血管を含む）についているので、外側を引き裂いていくことで房が袋状のものからフラットに変わる（ビニール袋に切開を入れて、1枚のビニールシートにするような感じ）。７）OR2を、50 mmシャーレに、3つ分くらい用意する。卵巣の房の一端をピンセットでもって、新しいOR2へ移す。 これを3回ほど行う。（死んだ卵をあらいおとすステップ）ピンセットで卵塊をつかんで、OR2-collagenase（1.0 mg/ml）入りの50 mlコニカルチューブへ移す。
８）Nutator（タイテック、MILD MIXER
PR-12など）で、揺らしながら、室温でインキュベートする。30分から40分。nutatorにはチューブを紙テープなどで固定して、落ちないように注意する。50 ｍｌコニカルチューブをゆっくり傾けてみて、卵がどの程度バラけているか見る。ほとんど、かたまりになっているようなら、まだ酵素処理がたりない。また、溶液のにごりも見る。かなり不透明なら、酵素をかえる。透明なら、効きがわるいので、さらにincubateする。
９）パスツールピペット（先端を直径5 mmくらいの大き目のサイズ）で、ふわっと数度ピペッティングする。ピペットのなかに卵を入れるというより、ピペットで、溶液をまぜながら、卵に吹きかける感じ。あわを入れないように注意する。これで、かなり酵素が満遍なく効いてくれる。
１０）剥きの状態をチェックするため、卵を10個程度、先が大きめのパスツールピペットでとりだし、実体顕微鏡下で、観察して、follicle membraneが剥けたかどうかチェックする。
すべての卵をバラバラにするのではなく、なるべく多くの卵が平面にくっついているような状態へもっていく。このステップは後での酵素処理の効率と均一なかかりかたに影響するので、卵をあまり傷つけないように丁寧に行なう。
むけ具合：つるっぱげが多い→むきすぎ。
卵の半数以上で、靴下の一部が破れたようにfollicle membraneがやぶれている感じ（卵の一部がやや突出しているようにみえることもある）→ちょうど良い
ほとんどむけていない。血管などが表面にかなり残っている→足りない
洗っている作業で、かなりむけていくので、チェックする段階でかなりむけているとむけすぎ。細胞の1－3割の数が、むけている程度がちょうど良い。
１１）むきがOKと判断したら、50 mlコニカルチューブから、デカントで、上澄みをすてる。あたらしいOR2をくわえ、またデカントする。3，4度くりかえす。上澄みが透明になるまで繰り返す。
１２）2－3枚のファルコン50mmシャーレにOR2を分注し、卵をパスツールピペットで順次移す。ピペットで卵を洗いながら、3度繰り返す。この操作により、一旦床に卵がfollicle membraneでくっつき、ピペットで洗うときに、卵だけが剥がれてくることで、follicle membraneが剥ける。
１３）顕微鏡下で、よい卵を選別し、ND96（50 mmシャーレ）に移す。
4，5時間おいて、さらに悪い卵を除く。
酵素の効きが強かったときは、一晩おいて、良い卵を選別する。
○Drummondのinjector（たとえば、Nanoinjector、Drummond製、フナコシ）と中芯のないガラスキャピラリー（径1mm）（例えばDrummond製）
１４）mMessage mMachineキット（Ambion）を用いてプロトコール通りRNAを合成する。ただし、合成後のDNase-I処理はRNAのクオリティーを悪くする場合があるので、省く。反応液の一部（10%-5%）を、通常のnon-denaturing
agarose gelで電気泳動して、RNAのクオリティーを確認する。RNAの精製はフェノール抽出により行なう。フェノールは細胞に有害なので、フェノール抽出後、クロロフォルム抽出を最低二度行なう。その後、NH4AcetateとIsoｐropanolで沈殿させ、20マイクロリットルの手術用の水（大塚）に溶かして、2マイクロリットルずつ10本程度(0.5
mlエッペンドルフチューブ)に分注しておく。ラベルして、Deep freezerに保存しておく。どのくらいの濃度のRNAを用いるかは実験の目的による。例えば、電位依存性Kvチャネル(Shaker
type)やNavチャネルmu1 (Nav1.4)は、1/10希釈でも濃いくらい。一度pilot実験で、様々な濃度のRNA溶液をinjectしてみて、適当な電流量が得られる濃度を調べてみると良い。また、Na
channelなどでは、gating currentの測定などのように、大量に発現させるためにTTXなどを培養液に加えておくこともある。
１５）1mm径のガラスキャピラリーをプラー（例えばサッターP97）で一段でひく。先のきれいなピンセットで、引いたガラス管の先を直視下で折る。顕微鏡で、先端の径が25-40ミクロン程度になるようになるまで折る。
○微小電極電位固定記録用アンプ：Oocyte Clamp 725C
(Warner Instruments
Co.)
２４）マニピュレーターを操作し、二本の針を細胞膜へ直角に当たるように近づける。二本の針の角度はなるべく大きく取ったほうがノイズが小さく、また電位固定が確実になる。RNAのinjectionのときと同じように、細胞膜を突き抜けるときに「戻り」を感じることができる。細胞内に入ると静止電位が出て、ゼロレベルから動き二つの針を入れたときには、VeもVmの計測値もほぼ同じ値になるはずである。
