3.1 Professor Hitoshi Kita, University of Tennessee, USA
An Evaluation of the Research Activity in the Department of Developmental Physiology; Dr. Nabekura group.
Writing an evaluation of the highly active and very productive laboratory headed by Dr. Nabekura is a great joy for me. Dr. Nabekura was a student about 30 years ago when I was a young staff scientist at Kyushu University. He was a bright and active student then, and now he is an energetic professor at the National Institute for Physiological Science (NIPS) organizing a cutting-edge and productive laboratory. He was an associate professor at the Department of Physiology at Kyushu University before taking the current position at NIPS in November of 2003. The main research target of his group for the last 10 years is to elucidate the mechanisms that underlie the developmental plasticity of nervous system. He has continued to study this main research focus in NIPS. His group has demonstrated that the central nervous system experiences massive remodeling and that similar plasticity takes place shortly after brain injuries and stress such as ischemia and epilepsy. These are exciting and important findings in understanding the detailed basic mechanisms governing the development of the central nervous system and also in the formulation of therapeutic treatment strategies of various neuronal damages. Because one of the missions of NIPS is to offer research facilities and perform collaborative studies with other institutions, Nabekura group also performs a wide range of collaborative studies. Many of these collaborative researches are yielding important results. I will highlight some of the research activity of the Nabekura group.
A. Research Highlights
a. The main research focus
Dr. Nabekura has a long-standing interest in understanding the mechanisms that underlie developmental plasticity of the central nervous system. The central nervous system experiences extensive remodeling during early stage of development. In many places, excessive neuronal connections, excessive numbers of axons with synapses, and large expanded dendritic processes are initially formed in early stage of development, which is by the end of first postnatal week in rodents. The excessive connections are eliminated and adult versions of connections are formed during the next postnatal week in rodents. Interestingly, a similar plastic changes take place during recovery after various injuries of nervous systems. One can formulate a number of important questions on these interesting developmental changes.
b. Switching of inhibitory neurotransmitters during development
When Dr. Nabekura was a postdoctoral fellow at Washington University at St. Louis, an attractive hypothesis that the excessive excitation at the early stage is involved in the elimination/selection processes was formed. This hypothesis was based on the observation that many GABAergic and glycinergic synapses in various loci in CNS switch from depolarizing excitatory to hyperpolarizing inhibitory synapses in an early stage of development.
Properly testing this hypothesis requires a preparation that allows activation of GABAergic or glycinergic inhibitory synapses independently to glutamatergic excitatory synapses. In most brain areas, inhibitory and excitatory synapses intermingle with each other and separate activation is not possible. After searching for such preparations, Dr. Nabekura begun to use the lateral superior olivary nucleus (LSO) in rats. LSO is an auditory relay centre in the brain stem that encodes interaural pressure level differences for sound localization. LSO integrates GABA/glycinergic inputs from the contralateral ear via the medial nucleus of the trapezoid body (MNTB), and glutamatergic inputs from the ipsilateral ear via the ventral cochlear nucleus (VCN). Thus, stimulation of MNTB or VCN selectively activates GABA/glycinergic and glutamatergic input to LSO.
It was found in his early experiments that MNTB to LSO synapses in rats switch from GABAergic to glycinergic inputs during postnatal day 8 to 14. Various possible mechanisms can be considered for the switching, including the development of glycinergic synapses and elimination of GABAergic synapses, switching of postsynaptic receptors, and switching of transmitters released from same synaptic boutons. The Nabekura group has investigated this important question using neurons dissociated by a unique enzyme-free, mechanical dissociation procedure in which functional terminals remained adherent to the neurons. He found that the switching from GABAergic to glycinergic inputs to LSO neurons occurs at the level of a single presynaptic terminal. Before postnatal day 8, only GABA release can be observed. At postnatal day 8 to 14, each synaptic vesicle contains both GABA and glycine (Nabekura et al., Nat Neurosci., 2004). Both physiological and immunohistochemical experiments confirmed these results. These findings are exciting because the switching of the transmitter is a novel form, not elimination or selection, of developmental plasticity at the level of a single central synapse and suggests the possibility that this could be one of mechanisms involved in the plasticity in neural circuit development.
What could be the mechanisms underlying the switching and why is the switching required? The Nabekura group has recently found that MNTB-LSO inhibitory synapses express GABAB receptors only when GABA is used as the transmitter, and activation of the receptor suppresses GABA release. Furthermore, the normal development of synaptic adaptation mechanism is impaired in GABAB receptor knockout mice. These results suggest that GABAB receptor activation is required for normal development of MNTB-LSO inhibitory synapses, and GABA is necessary to stimulate GABAB receptors. They have also found that VCN-LSO glutamatergic inputs heterosynaptically suppress MNTB-LSO inhibitory synaptic inputs (Nishimaki et al., Eur J Neurosci 26: 323-330, 2007). The suppression is due to a decrease of transmitter release probably by activation of group II metabotropic glutamate receptor (mGluR2/3) existing on MNTB-LSO presynaptic terminals. The suppression and the immunohistochemical staining of mGluR2/3 in the LSO can be observed only at postnatal day 4-8. These results suggest that mGluR-mediated heterosynaptic modulation of MNTB-LSO GABAergic/glycinergic transmission might also contribute to the development of appropriate adult auditory circuits. Nabekura is testing several other ideas to answer the question why GABAergic synapses are required in the early stage of development.
c. Developmental plasticity of intracellular Cl- regulation
GABAergic and glycinergic synapses in various sites in CNS switch from depolarizing excitatory to hyperpolarizing inhibitory synapses in an early stage of development, as mentioned previously. This switch has been demonstrated to be due to a developmental decrease in the intracellular Cl- concentration. One of the research aims of the Nabekura group is to reveal the cellular and molecular mechanisms that underlie this switch. Using mechanically dissociated neurons, his group has demonstrated that this change is due to developmental switch of intracellular CI- regulators, K+, CI- cotransporter2 (KCC2) and Na+, K+ Cl- cotransporter1 (NKCC1). Interestingly, recovery processes after cellular damages involve plastic changes similar to this developmental plasticity. Immediately after neuronal damages, KCC2 rapidly down-regulated their expression and function, resulting in an increase in intracellular Cl- and GABA-induced excitation in injured neurons similar to that seen in immature neurons. These are very important findings that have significant implications on the maturing and recovery processes of nervous systems. The next research target is to find mechanisms that govern the expression and function of KCC2. Some of the recent results of this challenge are highlighted below.
The Nabekura group has investigated the hypothesis of whether or not KCC2 activity is directly modulated by changes in phosphorylation during neuronal stressors. Examination of tyrosine phosphorylation of KCC2 in rat hippocampal neurons in vitro revealed that various neuronal stresses, such as oxidative stress and induction of seizure activity, instigated a rapid dephosphorylation of KCC2 and internalization of KCC2. These initial changes were followed by decreases in KCC2 protein or mRNA expression. Dephosphorylation of KCC2 was correlated with a reduction of transport activity and a decrease in intracellular Cl-. They have also found that manipulation of the KCC2 tyrosine phosphorylation site resulted in altered neuronal viability in response to oxidative stress. During continued neuronal stress, a late phase of functional KCC2 down regulation with a decrease in KCC2 protein expression level took place. These results suggested that neuronal stress induces a rapid loss of tyrosine phosphorylation of KCC2 that results in translocation of the protein and functional loss of transport activity (Wake et al., J Neurosci 27: 1642-1650, 2007). These finding are important because detailed understanding of the mechanisms involved in KCC2 regulation may provide a means for manipulating the extent of irreversible injury resulting from various neuronal stressors. The Nabekura group's KCC2 related research is expanding to include detailed structural analysis of KCC2 and factors governing the internalization.
The Nabekura group has tested another hypothesis that excitatory inputs can regulate KCC2 function and control intracellular Cl- concentration in both mature and immature neurons. To test this hypothesis, they have examined whether the Cl- equilibrium potential (ECl) shifts following glutamate application. Using the gramicidin perforated-patch technique to hippocampal dissociated cultured neurons, they have found that the Ca2+ influx through the activated NMDA receptors causes sustained down-regulation of KCC2 and shifts the ECl in a positive direction. The results suggested that the ECl shift is likely to contribute to postsynaptic excitability, LTP, and epileptiform discharges (Kitamura et al. sfn abstr 2007).
d. Developmental plasticity of GABA receptor expression
The expression of both GABAA and GABAB receptors on the neuronal membrane are tightly regulated. It was found that the regulation mechanism switches during early development. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) rapidly up regulates the surface GABAA receptor and induces long term enhancement of GABA-induced currents in amplitude in developing visual cortex and hippocampus of rat and mouse. BDNF action switches to rapid down-regulating surface GABAA receptor in the mature mouse. The switching involved phosphorylation of PRIP (PLC-related but catalytically inactive protein) through activation of PKC (Mizokami et al. J. Neurosci 2007). Collaboration with Dr. Hirata at Kyushu University, investigation on underlying mechanisms, including neural activity and GABAA receptor associated protein, are underway.
e. Presynaptic modulation of GABAergic synapses
A rich array of developmental plasticity also seems to occur at presynaptic sites. The Nabekura group has made significant contributions in this research area.
As mentioned above, BDNF rapidly modulates GABAergic responses through a postsynaptic mechanism during the development of the rat hippocampus. While a number of studies have revealed rapid effects of BDNF on GABAA receptor-mediated responses, the interactions between GABAB autoreceptors and BDNF are less clear. The Nabekura group has recently demonstrated that BDNF rapidly and reversibly occludes baclofen-induced suppression of GABAA receptor-mediated transmissions in mature rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. In hippocampal CA1 pyramidal neurons isolated from postnatal day 7 rats, BDNF failed to occlude the GABAB receptor-mediated inhibition of GABA release. The effect of BDNF in mature neurons was mediated via the activation of presynaptic TrkB receptor tyrosine kinases and subsequent activation of phospholipase C and protein kinase C. These results demonstrate a novel aspect of the role of BDNF in the induction of developmental plasticity of inhibitory transmissions in hippocampus and pathophysiology of epilepsy (Mizoguchi et al., Eur J Neurosci 24: 2135-2144, 2006).
B. New Research Direction
In addition to the plasticity of GABAergic and glycinergic synapses in developmental and in recovery after injuries, Nabekura lab has initiated a new direction of research using two-photon laser-scanning microscopes. The research aim is the examination of structural remodeling and functional integration of the cortex. The two-photon microscopy can be a powerful tool to visualize the neuronal circuits and the fine structure of the central nervous system in vivo. The Nabekura lab has acquired a two photon microscope and set it up for in vivo use in 2006. Because the system is unique, the set up itself requires various experiments. For instance, they have developed four-direction head fix bars to alleviate heartbeat and breathing of mice. They also developed a thin skull method to improve the resolution of signal and contrast. In a short period, they have succeeded in overcoming technical hurdles and is now acquiring images with astonishing resolution from living animals. Below are some of the recent results on remodeling of cortical structures during development and after neuronal damages.
a. Axonal structural plasticity of pyramidal neurons and microglias in damaged cerebral cortex of living mice
It has been shown that peripheral neuronal networks undergo characteristic structural remodeling after injury. The Nabekura lab suspects that structural remodeling of the nervous system also takes place in the central nervous system during recovery after various neuronal damages. They also suspect that the remodeling is similar to the developmental remodeling. In this year’s Neuroscience meeting, the Nabekura group demonstrated that the appearance and disappearance of synaptic bouton-like structures of cerebral pyramidal neurons increased within 2 weeks and returned to the control level at 4 weeks after the ischemic damage of mice cerebral cortex. Focal cell damage caused by a laser also introduced a rapid change of processes movementof microglias following the transposition of their cell bodies toward the damaged cells (Wake et al., sfn abstr 2007). The study on the microglia movements is expanding with incorporation of a new method to induce focal short duration ischemia by occluding and reopening a blood vessel by two laser beams. The preliminary results show very interesting movements of microglia foot process toward synaptic boutons on spines. It appears the glial processes are contacting and testing synaptic sites to determine their conditions. These are very interesting observations that can be shown only using high-resolution two photon microscopes.
b. Migration of cortical interneurons during postnatal development
It has been known that most GABAergic interneurons of the rodent cortex originate from the ganglionic eminences. During perinatal days, the interneurons migrate tangentially through the marginal zone (MZ) as well as intermediate zone/subventricular zone towards the cortex. After reaching the cortex, they migrate into the cortical plate and incorporate into the proper laminar position. To visualize the movement of the migrating interneurons in living intact immature animal, Nabekura lab has developed in vivo time-lapse imaging of mice GABA-positive interneurons expressing Venus with two-photon microscopy. Immunohistochemical examination confirmed that over 97% GABA-positive interneurons in the transgenic mice express Venus. For the first time, the Nabekura lab has succeeded in visualizing the migration of GABAergic interneurons in the MZ of a living animal. Interestingly, four-dimensional reconstruction revealed that when analyzed in a short segment of time, the direction of movement of each interneuron is not unidirectional. Each cell moved to a certain direction but the direction of each cell was not correlated with direction of movement of others. Thus, each cell must make zigzag movements before reaching the cortical plate. This is a very interesting observation that can also only be made only by high-resolution two-photon microscopes. They now have proof that two-photon microscopy is a powerful tool for understanding neural activity in the developing intact brain (Inada et al., sfn abstr 2007).
C. Research Productivity
Dr. Nabekura has published 23 papers in last five years including 8 papers in 2007 alone. Some of these publications are results of collaborative studies with Kyushu University, his previous institution, and other national and foreign institutions. Many of these papers appeared in highly regarded journals such as Nature, Neuroscience, Journal of Neuroscience, and Journal of Neurophysiology. During my visit, I was introduced to more exciting recent results by his group, indicating that mcu more will be accomplished and publications are soon to follow.
D. Laboratory staff and laboratory facilities: Dr. Nabekura's active and positive thinking attitude and logical manner of attacking scientific questions appear to attract many excellent people to join his laboratory. The graduate students, fellows, and staff in the laboratory are highly motivated and very knowledgeable. During past four years, already two staff members and 4 postdoctoral fellows took new positions in different research institutions. Newly added staff include Dr. Ishibashi, an associate professor since 2007. New graduate students join the laboratory every year. The high rate of staff turnover is a very good indication of successful laboratory education and management.
Overall, the facilities meet the present needs of the projects being conducted. The laboratory includes 3 electrophysiology rooms equipped with 5 patch clamp electrophysiology rigs capable of multiple simultaneous recordings, a well-equipped tissue culture room, and a molecular biology room. Two two-photon microscopes for in vivo preparations and two other two-photon microscopes for in vitro preparations are currently available. One of the missions of the NIPS is to promote and accept collaborative studies with other institutes. Dr. Nabekura is receiving a wide range of new exciting collaborative study proposals using these microscopes, and some collaborative studies have been already initiated. I think that additional institutional support of properly trained maintenance staff and a computer programmer specializing in image analysis are required to expand further collaborative studies using these two-photon microscopes.
E. Summary
Dr. Nabekura is a highly regarded and internationally recognized senior neurobiologist, with an excellent track record of publications. The publication record as well as their future plans clearly indicated to me that the Nabekura laboratory has a clear research focus. The laboratory is very active, and the enthusiastic staff and students enjoy their research. Their accomplishments are evidenced by a large number of publications. In my judgment, Nabekura laboratory deserves high accolades. Finally, I would like to express my sincere thanks for giving me the opportunity to write this review. I have learned a lot about the developmental plasticity of nervous system.
（和訳）
発達生理学研究系生体恒常機能発達機構研究部門（鍋倉教授研究室）の研究活動に関する評価
鍋倉博士の担当する大変活気のある研究室の評価をする機会を得てたいへん嬉しく思います。鍋倉博士は30年前に私が九州大学の若手研究者であったときの学生でした。現在、彼は生理学研究所の活気に満ちた教授であり、最先端の研究成果をあげている研究室を担当しています。彼は、2003年11月に九州大学医学部生理学教室の助教授からNIPSに現職として着任しました。彼のグループの最近10年間のターゲットは、神経系の発達可塑性のメカニズムを解明することにあります。彼のグループは、中枢神経系が大規模な神経ネットワークの再編成を経験していることや、同様の可塑性が虚血やてんかんなどの病気やストレスの後に再現することを明らかにしてきました。そのなかには、中枢神経系の発達を支配する詳細なメカニズムを理解するとともに、種々の神経疾患のための治療の戦略を公式化するための、エキサイティングで重要な発見があります。NIPSの任務の１つには、研究設備を提供して他の研究期間と共同研究を遂行することがあるので、鍋倉グループも広範囲の共同研究を行っています。これらの共同研究から多くの重要な成果が得られていますが、鍋倉グループのいくつかの研究活動に焦点をあてみます。
A. これまでの主な研究の概要
a.主な研究の焦点
鍋倉博士は中枢神経系の発達可塑性のメカニズムを解明することに長年にわたって興味を持っている。中枢神経系は未熟期には神経ネットワークの広範囲な再編成を行いる。多くの脳部位で、過剰な神経回路結合（過剰な数の軸索と大きく広がった樹状突起）が発達の初期の段階で形成される。その後、過剰な結合は除去され、成熟型の結合が形成される。面白いことに、種々の神経傷害からの回復過程で同様の可塑的変化が起こる。これらの興味ある発達変化に関して多くの重要な問題があることは誰の目にも明らかである。
b. 発達期における抑制性伝達物質のスイッチング
研究室では、未熟期のGABA活動が興奮が神経線維の脱落／選択に重要であるという魅力的な仮説を立てている。この仮説は、発達初期の中枢神経系の様々な部位で、多くのGABA作動性およびグリシン作動性シナプスが興奮性から抑制性にスイッチするという知見に基づいている。この仮説を適切に検証するためには、GABA作動性またはグリシン作動性の抑制性シナプスをグルタミン酸作動性の興奮性シナプスから分離して記録する標本が必要であるが、多くの脳領域では、抑制性と興奮性のシナプスはお互いに混在しており、それらをお互いに分離して活性化することは不可能である。
そこで、鍋倉博士は独自に見出した音源定位機能に関連するラット上オリーブ核（LSO）をモデル回路として用いてる。LSOは内側台形体核（MNTB)を経由する反対側の耳からのGABA／グリシン入力と蝸牛神経核腹側核（VCN）を介する同側の耳からの興奮性入力を統合しています。従って、MNTB を刺激することによりLSOに入力するGABA/グリシン作動性神経線維を、VCNを刺激することによりLSOに入力するグルタミン酸作動性神経線維を選択的に活性化することができ、この研究目的に最適な回路です。 彼の初期の実験で、ラットのMNTBからLSOへのシナプスは生後８日から14日にかけてGABA作動性からグリシン作動性へスイッチすることが明らかとなった。このスイッチングには、グリシン作動性シナプスが強化とGABA作動性シナプスの脱落、、１つの神経終末部から放出される神経伝達物質自体のスイッチなど、種々のメカニズムの可能性が考えられた。この重要な研究課題について、酵素を使用せずに機械的処理のみによって、神経終末部が付着した状態で単離した神経細胞を使用して研究を行ってきた。その結果、LSOへのGABA作動性からグリシン作動性への入力のスイッチングが単一神経終末部レベルで起こっていることを生理学的および免疫組織化学的な実験により明らかにした。（鍋倉ら、Nat Neurosci., 2004）。神経伝達物質のスイッチングは中枢神経系ではまったく新たな回路再編成の概念であるとともに神経回路の発達可塑性に関する１つのメカニズムである可能性を示唆しており、これらの発見は大変興味深いものである。
このスイッチングの基盤となるメカニズムがどの様なもので、なぜスイッチングが必要なのだろうか。最近、鍋倉グループは、GABAが神経伝達物質として使用されている未熟期には、MNTB-LSO抑制性シナプスは GABAB 受容体を発現しており、これらの GABAB 受容体を活性化すると GABA 放出が抑制されることを発見した。さらに、GABAB 受容体ノックアウトマウスでは、シナプスの高頻度入力に対する適応機構の正常な発達が阻害されることを明らかにしている。これらの結果から、GABAB 受容体の活性化はMNTB-LSO抑制性シナプスの正常な発達に必要であり、GABA はそのGABAB 受容体を刺激するために必要であると考えられる。
彼らは、VCN-LSO の興奮性入力が MNTB-LSO の抑制性シナプス入力を抑制することを明らかにした（西巻ら、Eur J Neurosci, 26:323-330, 2007)。この抑制は、MNTB-LSOの抑制性シナプス終末部に存在するグループ II 代謝型グルタミン酸受容体（mGluR2/3)の活性化によって、神経伝達物質放出が減少したことにより起こる。この現象は生後 4-8 日齢のみで認められている。これらの結果から、mGluR による MNTB-LSO のGABA／グリシン作動性シナプス伝達の修飾もまた聴覚神経回路の適切な発達に寄与していると考えられる。鍋倉は、なぜGABA作動性シナプスが発達の初期段階で必要なのかという疑問に答えるために、他のいくつかのアイディアについても検討を行っている。
c. 細胞内 Cl- 濃度の発達による制御
前述の様に、GABA作動性シナプスとグリシン作動性シナプスは、中枢神経系の多くの部位で発達初期に興奮性から抑制性にスイッチする。このスイッチは、発達により細胞内 Cl- 濃度が減少することにより起こることが証明されている。鍋倉グループの研究目的の１つとして、このスイッチングの細胞レベル・分子レベルでのメカニズムの解明がある。彼のグループは、この変化が細胞内 Cl- を調節する K+, Cl- 共輸送体 2 （KCC2）と Na+, K+, Cl-, 共輸送体 1（NKCC1）の発達スイッチにより発生していることを証明してきた。面白いことに、細胞傷害の後の回復過程でもこの発達可塑性と同様の可塑的変化が認められる。神経傷害の直後、KCC2 の発現と機能はすぐに低下し、傷害を受けたニューロンでは、幼若期のニューロンと同様に、細胞内 Cl- 濃度の増加と GABA による興奮が見られる。これらは、神経系の成熟と回復過程に関する大変重要な発見である。次の研究のターゲットは KCC2 の発現と機能を制御するメカニズムを発見することであり、この取り組みに関するる最近の結果を以下に示す。
また、KCC2のチロシンリン酸化を検討することにより、酸化ストレスやけいれん活動によってKCC2 の素早い脱リン酸化とその内在化を起こすことを明らかにした。KCC2 の脱リン酸化は、トランスポーター活性の減少と細胞内 Cl- 濃度の増加と相関していた。彼らはまた、KCC2のチロシンリン酸化部位を操作することにより、KCC2機能の低下を証明しています。この変化により、神経細胞の生存率を変化することを示唆した（和氣ら、J Neurosci 27:1642-1650, 2007)。KCC2の制御メカニズムを詳細に理解することにより、種々の神経ストレスによって引き起こされる不可逆的な傷害の程度を操作する手法を開発できるかもしれないので、これらの発見は重要である。鍋倉グループのKCC2に関する研究は、KCC2の詳細な構造解析や内在化を支配する因子に関する研究へと広がっている。 さらに、興奮性入力がKCC2の機能を制御して細胞内Cl- 濃度を制御し得るのではないかという仮説についても検証している。この仮説を検討するため、彼らは、Cl- イオンの平衡電位（ECl）がNMDA受容体を介して流入するCa2+ によってKCC2の機能が持続的に低下し、ECl が正の方向にシフトすることを発見した。この結果は、EClのシフトがシナプス後細胞の興奮性、LTPやけいれん波の発生等に関与している可能性を示唆している（北村ら、sfn abstr 2007）。
d. GABA受容体発現の発達可塑性
GABAA 受容体と GABAB 受容体の神経細胞の細胞膜上への発現は厳密に制御されている。その制御メカニズムは発達初期の間にスイッチすることが明らかとなっている。脳由来神経栄養因子（BDNF）を発達期の大脳皮質視覚野の神経細胞や海馬の神経細胞に投与すると、GABAA 受容体の細胞膜上の発現が急速に増加し、GABA 誘発電流の長期にわたる増加が見られる。一方、成熟したマウスでは、BDNF により GABAA 受容体の細胞膜上での発現は低下する。このスイッチングには PKC による PRIP（PLC-related but catalytically inactive protein）のリン酸化が関与している（溝上ら、J Neurosci 2007）。九州大学の平田博士との共同研究により、神経活動とGABAA 受容体関連蛋白質に関する研究が、進行している。
e. GABA作動性シナプスのシナプス前修飾
発達期には多くの可塑的変化がシナプス前神経終末部でも起こっている様である。BDNF の GABAA 受容体応答に対する素早い作用は多くの研究が報告されているが、GABAB オートレセプターと BDNF の相互作用はほとんど明らかになっていない。鍋倉グループは最近、成熟ラットの海馬 CA1 錐体細胞における GABA 作動性シナプス伝達のバクロフェンによる抑制が BDNF によって急速かつ可逆的に減少することを明らかにした。生後７日齢のラットから単離した海馬 CA1 神経細胞では、GABAB 受容体によるGABA 放出の抑制は BDNF で影響を受けなかった。成熟した神経細胞におけるBDNF の効果は、シナプス前神経終末部の TrkB 受容体チロシンキナーゼの活性化とそれに続くホスホリパーゼC およびプロテインキナーゼ C の活性化が関与している。これらの結果は、海馬における抑制性シナプス伝達の発達可塑性やてんかんの病態生理における BDNF の新たな役割を明らかにしている（溝口ら、Eur J Neurosci 24: 2135-2144, 2006）。
B. 新しい研究の方向性
発達期や傷害からの回復期における GABA 作動性シナプスとグリシン作動性シナプスの可塑性に加え、鍋倉研究室は２光子レーザー顕微鏡を用いて新たな研究を始めている。この研究の目的は、大脳皮質の構造的な再構成と機能的な統合を調べることです。２光子顕微鏡はインビボにおいて神経回路や中枢神経系の詳細な構造を可視化するための強力な道具です。鍋倉研究室は、2006年に２光子顕微鏡を取得してインビボ観察のためにセットした。システムが独特であるため、セットアップ自体は多様な経験が要求される。例えば、マウスの心拍や呼吸を楽にする４方向頭部固定棒の開発や、シグナルの解像度やコントラストを改善した状態で観察が可能になる様に頭蓋骨を薄く削る手法の開発を行なっている。短期間のうちに、彼らは技術的なハードルを克服することに成功し、現在では、生きた動物からびっくりするような解像度の画像を得ている。発達期と傷害後の大脳皮質構造の再編成に関する最近の研究成果の一部を以下に示します。
a. 傷害を受けた大脳皮質における錐体細胞軸索の構造的可塑性とミクログリア ～生きているマウスでの観察～
神経細胞が傷害を受けると構造的な再編成が起こることが末梢神経系で報告されてきた。鍋倉研究室では、種々の神経傷害後の回復期において、同様な構造的な再編成が中枢神経系でも起こっているのではないか、再編成が発達期の再編成と類似しているのでないかと推測している。マウス大脳皮質を虚血にして傷害を与えると、その後２週間以内では、大脳皮質錐体細胞のシナプスブートン様の構造の出現と消失の頻度が増加しており、４週後にはそれがコントロールのレベルまで戻っていることを示した。また、レーザーによる局所的な細胞傷害によって、ミクログリアの突起の運動がすぐに変化し、ミクログリアの細胞体が傷害をうけた細胞の方向へ移動することを紹介した(和氣ら, sfn abstr 2007)。
レーザー光を用いることにより血管を閉塞し、さらに別の波長のレーザー光により血管の閉塞を解除することが可能で、この方法によって局所的で短時間の脳虚血を起こすことが出来る。この手法をミクログリアに関する研究に取り入れることによって、ミクログリアの運動に関する研究は広がりを見せている。予備実験では、ミクログリアの突起がスパイン上のシナプスブートンに向かって動いているという大変興味深い結果を得ている。それは、あたかもそのグリアの突起がシナプスに接するとともにシナプスの状態を検証している様である。これらは、高い分解能を有する２光子顕微鏡を使うことでのみ示すことが出来る非常に興味深い知見である。
b. 生後発達の期間における大脳皮質介在ニューロンの移動
齧歯動物大脳皮質のほとんどのGABA作動性介在ニューロンは基底核原基に由来する。周産期には、介在ニューロンは、中間帯／脳室下帯と同様に、辺縁帯(MZ)を皮質半球接線方向に大脳皮質に向かって移動する。大脳皮質に到着すると、介在ニューロンは大脳皮質板に移動し、固有の位置に組み込まれる。生きている幼若動物において移動している介在ニューロンの動きを可視化するために、鍋倉研究室は、GABA陽性介在ニューロンがVenus を発現しているマウスを用いて、インビボにおける介在ニューロンの動きを2光子顕微鏡で経時的に観察する方法を開発した。免疫組織化学的な検討により、この遺伝子改変マウスでは、97%以上のGABA陽性介在ニューロンがVenusを発現していることを確認している。鍋倉研究室は生きた動物のMZでGABA作動性の介在ニューロンの動きを可視化することに成功した。面白いことに、短時間の観察を4次元で再構成することによって、介在ニューロンの動きの方向が単一ではないことが明らかとなった。それぞれの細胞は決まった方向に動いたが、その方向は他の細胞の動きの方向と相関がなかった。従って、それぞれの細胞は大脳皮質板に到達するまでジグザグ運動をしていると考えられた。これは高分解能の２光子顕微鏡を用いることによって初めて可能となる非常に興味深い観察で、２光子顕微鏡が発達期の脳の神経細胞の活動を理解するための強力な道具となっていることを証明している (稲田ら, sfn abstr 2007)。
C. 研究の生産性
最近の５年間で 23 報の原著論文を、2007年単独でも 8 報の原著論文を発表している。これらの論文の中には、九州大学やその他の国内外の研究機関との共同研究による論文も含まれている。これらの論文の多くは Nature Neuroscience、Journal of Neuroscience や Journal of Neurophysiologyなど高い評価を受けている学会誌に出版されている。私の滞在期間中、彼らのグループによって行われているより興味深い最新の研究成果を紹介された。すなわち、これまで以上の研究成果が達成されて論文もまもなく出版されるだろうと考えられる。
D. 研究室のスタッフと研究設備
鍋倉博士の活発でポジティブな考え方と科学的な課題に対する論理的な態度は、多くの優秀な人材をひきつけて彼の研究室へ参加させていると考えられる。研究室の大学院生、博士研究員と職員は意欲が高く知識も豊富である。最近までの４年間で、２人の研究教育職員と４人の博士研究員が異なった研究機関の新しいポジションに異動した。2007年からは、新しく石橋博士が准教授として研究室に加わった。新しい大学院生も毎年研究に参加している。高い頻度で研究者の入れ替わりがあることは、研究室の教育と運営を成功させるこために非常に良いことである。 全体的にみて、研究設備は現在行われているプロジェクトに必要なものを満たしており、3部屋の電気生理測定室には5台のパッチクランプ装置があり、その他に、必要なものが良く揃っている組織培養室と分子生物学的実験室がある。インビボ標本のための2光子顕微鏡が2台と、その他にインビトロ標本のための2台の２光子顕微鏡が現在利用可能である。NIPSの任務の一つに、他の研究機関との共同研究を受け入れてその研究を推進することがあるが、新たな興味深い共同研究の提案を広く受け入れるとともに、すでに開始した共同研究もある。 私の意見として、これらの２光子顕微鏡を使用して共同研究をさらに拡大するには、十分に訓練を受けた整備スタッフとイメージングの解析を専門とするコンピュータプログラマーを研究機関からサポートしてもらう必要がある。
E. 要約
生体恒常機能発達機構研究部門は、これまですばらしい論文を発表してきています。彼らの将来の計画と同様に、発表論文からも、同研究室が明確な研究方針を有していることが明確に理解できました。研究室は大変活気があり、研究に熱中しているスタッフや学生は彼らの研究を楽しんでいます。彼らが目的を果たすであろうことは、多数の発表論文から明らかであります。私の判定では、同研究室は高い称賛を得るのに値すると考えられます。最後になりましたが、この論評を書く機会を与えて頂いて大変感謝しています。私は神経系の発達可塑性に関する多くのことを学ぶことができました。
3.2慶応義塾大学 岡野栄之 教授
外部評価（生体恒常機能発達機構研究部門）
鍋倉教授は2003年11月に新設された発達生理学研究系3部門の一つの担当教授として着任し、約4年経過している。その間、人事として2004年4月に着任した張一成助教授、前島隆司助手は既に転出し、2007年1月から石橋仁准教授が着任するなど、スタッフの流動性も良好である。また、博士研究員および総研大大学院生も毎年は受け入れるなど、研究・教育体制は順調に整いつつある。
研究に関しては、鍋倉教授の主たる課題である「抑制性神経回路機能の発達変化」を着任後も継続しておこなっている。更に、近年は障害回復期と発達期の変化を対比し、回復と発達との類似性について、細胞機能および回路レベルでの検討を加えている。その中でも、特にGABA機能をダイナミックに変化させる細胞内Cl-濃度の発達・障害細胞における変化に注目し、その主な制御機構であるCl-くみ出し分子KCC2の機能発現変化を電気生理学・分子生物学的手法を用いて検討している。
GABA受容体機能の発達・障害時変化
未熟期には神経細胞内Cl-くみ出し分子であるKCC2発現が低く、汲み入れ分子NKCC1の機能が相対的に高いため、細胞内Cl-濃度は高く維持されている。そのため GABAはCl-流出を引き起こし脱分極作用を示す。発達に伴うKCC2発現・機能増加と細胞内Cl-濃度低下により、GABAは成熟期の過分極作用を獲得する。このKCC2機能の発達変化は鍋倉教授の研究グループなどが明らかにしてきた。近年、同グループは、酸化ストレスや機械的障害などの急性障害時、過剰興奮およびBDNF投与によってKCC2の脱リン酸化が起こり、KCC2の内在化により細胞膜上の発現が減少することを明らかにした。その後、KCC2蛋白自体の発現低下が起こり、障害細胞の細胞内Cl-濃度の更なる上昇、それにともなうGABA脱分極が再現することを報告している。また、KCC2の細胞膜上分布の特徴として、リン酸化KCC2はLipid Raftでoligomerを形成しクラスターを作っていること、また、C-terminal deletion mutantでは機能消失とともにraftにおける発現が消失するなど、同分野における新たしい知見を得つつある。今後は、細胞内結合蛋白の同定、およびリン酸化KCC2との関連を明らかにすることを期待したい。
また、GABA受容体の発達機能制御においては、幼若期にはBDNFが細胞内PLCγを介してGABAA受容体自体を内在化させ、GABA機能を長期に抑制することを報告している。また、BDNFによるGABA受容体γサブユニットの内在化にはPRIP（PLC-related catalytically inactive protein）分子が関与することなど、GABA受容体の動態を中心に国内外の共同研究を行っている。 障害による未熟特性の再出現について、GABA受容体以外にも神経伝達物質放出やK+イオンチャネル機能制御に関連する分子であるNeuronal Ca2+ sensor1が障害により再びその発現が増加し、細胞死を抑制していることなど興味深い成果を出している。
抑制性神経伝達物質の発達スイッチング
適当な生体内モデル回路が少ないために解明の遅れている抑制性神経回路の発達変化について、対側耳からの音情報を内側台形体核から外側上オリーブ核へ伝える抑制性入力回路にいち早く注目し、その発達変化の解析をおこなっている。注目すべき成果として、この抑制性シナプスにおいて、伝達物質自体が幼若期のGABAからグリシンへと発達スイッチすることを報告している。伝達物質自体が同一シナプス終末内で変化する報告は中枢神経回路では今までなく、新たな発達可塑性の提案であり非常に興味深い。更に、共にCl-チャネルを開口する伝達物質間でスイッチが起こる理由について、グリシン受容体には存在が確認されていない代謝型GABAB受容体に注目し解析を進めている。その結果、GABAB受容体自体も伝達物質のGABAからグリシンへのスイッチと同時期に発達消失することを確認している。現在、幼若期のみにGABAB受容体が発現している理由について、GABAB-R1サブユニットKOマウスを用いて検討を行っており、幼若期のGABAB受容体は同抑制性回路の抑制性伝達物質放出確率の発達安定化に関与している結果を得ている。今後、同回路が関連する音源定位の行動実験を組み合わせて生理学的な意義付けを期待したい。 また、同抑制性神経終末に存在する代謝型グルタミン酸受容体も発達に伴い消失することを報告し、GABAB受容体消失および開口時間の短いグリシンへ伝達物質の発達変化とともに、音源定位というタイミングが重要な機能抽出のために可塑性の少ない機能回路が発達とともに形成されていく過程を観察していることは興味深い。
多光子励起法を利用した脳回路の生体内観察
鍋倉教授の研究室では、これまでそれぞれの時期に対応したモデル動物から得られたin vitro標本を用いて検討してきているが、発達および障害回復という長期的変化の本質的な検討は、生体での経時的観察が不可欠である。そのため、2006年に、多光子励起法を用いた生体観察用顕微鏡システムの構築に着手した。その後、レーザー光学系および生体動物への装着器具の技術改良を行い、世界最高レベルの深部解像度を持つシステムを作り上げている。現在、細胞微細構造およびカルシウム感受性色素を用いた細胞活動記録の技術的な確立をおこなうとともに、いくつかの研究課題を遂行している。一つの課題である「障害後のシナプス構造のリモデリング」に関しては、レーザーを用いた虚血作成法と組み合わせ、障害領域のシナプス構造が障害後２週間にわたり発現・消失を繰り返し、その後安定化することを観察している。また、Iba-1 GFPマウスとThy1 GFPマウスを交配させたマウスにおいて、ミクログリアとシナプス連関を明らかにしつつある。正常状態では、静止ミクログリアはシナプス構造を分単位の一定時間で接触を繰り返すが、障害後には接触時間が飛躍的に増加するなど興味深い結果が得られている。また、多光子観察技術の未熟動物への適用技術確立とへ並行して行っている「未熟期における大脳皮質表面のＧＡＢＡニューロンの遊走観察」について、速度および方向性などのin vivoにおける基本情報を得つつある。現在は、長期イメージング技術の改良・最適化が一段落した段階であり、今後大脳皮質の回路構造・可塑性についてテーマを絞って集中的に行うことを期待する。 共同研究機関としての役割として、生理研の２光子室で２台の正立顕微鏡（生体用）と２台の倒立顕微鏡（スライス・培養用）を用いて、他機関から神経科学・その他の分野からの多くの共同研究を受け入れている。来年度から生理研の計画共同研究として、更なる大学や他機関との共同研究が発展するものと思われる。今後、多光子励起法の需要は飛躍的に増大すると思われ、同機器を取り扱える人材の育成も含めた姿勢が望まれる。
総括と感想
鍋倉教授は、産婦人科医としての臨床経験をもつという、神経生理学者としてユニークなキャリアを有する。その独特な慧眼に基づき、胎児の動きの発達過程における変化の観察からヒントを得て、発達過程における抑制性伝達物質への応答が脱分極性から過分極性へと転換することを記載し、そのメカニズムの分子レベルの解明へと至った一連の研究成果は、見事で生理研へ着任後、研究が順調に発展していることが確認された。抑制性伝達物質への応答性の変化は、成体ニューロン新生や損傷後の修復反応においても起きていることが示されており、今後神経系の再生医学における機能的な側面においても極めて大きなインパクトを持つであろう。神経再生の研究者との共同研究など、今後の展開が大いに期待できるものと考える。
3.3 東京大学 河西 春郎 教授
生体恒常性機能発達部門の評価
生体恒常性機能発達部門は鍋倉教授が2003年11月に着任して始まり、現在まで約４年間が経過したところである。鍋倉教授は着任後も以前からの研究を継続し、神経回路発達、特に抑制性神経回路発達変化に力点を置いて研究を行ってきた。なかでも、「神経伝達物質の発達スイッチング」という発見に基づいた神経終末のリモデリング機構の研究は他に類例がない独創的な研究である。また、シナプス後細胞のGABA受容体応答の変化については、その機能のダイナミックな変化をもたらす細胞内Cl-濃度の変化に注目し、細胞内Cl-濃度調節分子、なかでも発達期変化の著しいKCC2について、機能特性および制御機構を電気生理および分子生物学的手法を用いて解析している。発達期の抑制性シナプス変化とともに、再生・回復において未熟機能の再現および発達期と類似した過程が繰り返される可能性についても、抑制性伝達を中心に検討してきた。これまでのin vitro系での検定系に加え、発達・回復時に起こる変化を生体で観察するために、2006年から2光子励起法によるin vivo観察システムの構築を開始、技術改良を重ねて実用化し、生体における神経回路の形態および機能変化の観察を順調に進めている。人事は、2004年4月に着任した張一成助教授、前島隆司助手が、既に栄転・転出し、2007年1月から石橋仁准教授が参画するなど、研究スタッフの入れ替えが盛んに行われている。
以下に、抑制シナプスにおける発達変化と２光子励起法を用いた生体微細構造観察のそれぞれについて活動状況を概説する。
１．抑制性シナプスにおける発達変化
抑制性回路モデルとして、聴覚中継路核である外側上オリーブ核に入力する抑制性シナプスを使用している。このモデル回路は同側耳からの音入力を興奮性として、対側音入力を内側台形体核（NMTB）から成熟期にはグリシン入力として受けている。そのため、発達期の回路リモデリング調節要因であるシナプス伝達活動を制御でき、特に抑制性シナプス活動を生体で選択的に制御可能な最適回路である。この抑制性回路において伝達物質自体がGABAからグリシンへ発達スイッチすることを、中枢神経系で始めて報告している。これは、これまで多くの報告のある受容体の発達変化、伝達物質の放出効率の変化、およびシナプス除去などのシナプス連絡自体の変化と並ぶ新たな回路発達変化のカテゴリーであり、その後、多くの部位で伝達物質のスイッチが国外の研究室から報告されるなど大きなインパクトを与えてきた。現在、同回路において代謝型GABAB受容体に注目し、幼若期におけるGABA伝達・GABAB受容体発現の意義を検討するため、GABAB受容体ノックアウトマウスを用いて解析をおこなっている。同ノックアウト動物では成熟後も伝達物質放出確立の幼若期の性質が残存していることを見出し、GABAB伝達の回路機能発達における重要性を提示しつつある。また、同抑制性終末における代謝型グルタミン酸受容体の発達消失も見出しており、音源定位という厳格なタイミングが求められる回路において、応答持続の長い各種代謝型伝達物質受容体の消失、更には、GABAから開口時間のより短いグリシン伝達へと変化することにより、この回路の生体機能抽出のための最適な特性の獲得過程を記述できたことは高く評価される。今後は、個体における行動との対応を検討することを期待したい。 シナプス後細胞のGABA／グリシン応答の発達変化については細胞内Cl-濃度変化に注目している。GABA／グリシンはCl-チャネルを開口させるため、細胞内Cl-濃度変化はその機能にダイナミックな変化を与える。特に、細胞内Ｃｌ-汲みだし分子であるKCC2の機能が発達増加することは、これまで同研究室などから報告されているが、加えて、障害時にはKCC2の脱リン酸化による細胞膜からの消失、その後の蛋白自体の消失によってKCC2機能消失がおこり、その結果、GABAは幼若期と同様の興奮性を再獲得することを明らかにしている。さらに、KCC2機能の発現に、そのリン酸化とリピッドラフトにおけるクラスタリングが必要であることを明らかにしつつある。今後、KCC2のクラスタリングにおける細胞内結合蛋白の同定など更なる検証をおこなうとともに、生理学的意義について、回路機能変化の解明に立った研究を行うことが期待される。
2007年1月に着任した石橋准教授は、中枢神経細胞の急性単離法および各種穿孔パッチクランプ法などを用いて、in vitroにおけるシナプス伝達および各種イオンチャネル機能への高い技術を用いたアプローチを行っている。着任して間もないが、現在、研究室のメインテーマの一つであれる「GABAとグリシンの伝達物質のスイッチング」の背景にあるメカニズムとして、終末内の伝達物質濃度決定機構について検討を行い、神経終末における抑制性伝達物質（GABAおよびグリシン）の濃度の予測という、いままで全くブラックボックスであった分野についてチャレンジを行っており、いくつかの興味深い予備結果を出している。
２．多光子励起法を用いた生体微細構造観察
2光子励起法を利用した生体脳内微細構造観察に特化したシステム構築を、根本准教授と共同で2006年に行い、以後スムーズに稼動している。その後、生体装着機器の改良および光学系の改良をすすめ、その深部微細構造の観察技術は優れたものを達成している。また、同一動物における同一微細構造の長期繰り返し観察技術の改良も行い、現在１ヶ月以上のフォローが可能となっている。同システムを利用した現在の研究課題として、「発達期におけるGABA細胞の移動」および「障害後の神経回路の変化」の解析が進みつつある。「発達期におけるGABA細胞の移動」については、新生児マウスにおいて長時間の生体観察をおこなうため、観察部位の厳密な温度コントロールをおこなえる生体装着チェンバーの作成を独自におこない、VGAT-GFPマウスにおいて大脳皮質GABAニューロンの遊走の観察に成功し、移動の方向性および速度など、これまでのin vitroにおける報告と異なる結果も得ている。まだ、データとしては予備実験程度であるが、今後、同分野における主流となる実験系の確立をおこなったことは評価される。
「障害後の神経回路の変化」については、この課題開始後、いち早くクリプトンおよびYAGレーザー照射による血管閉塞-再還流モデル作成技術の確立を行い、安定した脳梗塞モデル動物の作成に成功している。このモデルに2光子励起技術を適用し、脳梗塞障害後の脳内回路および各種細胞構造の生体内イメージングをおこなっている。現段階では、障害後2週間にわたり神経終末ブートン様構造の発現・消失リモデリングが起こる可能性を示唆する結果を得ている。今後、シナプス後構造であるスパインとの対応を解決することが期待される。加えて、障害により活性化されるミクログリアの生体内動態の解析をおこなっている。その中で、今まで殆ど不明であった静止状態のミクログリアの役割について、その突起動態とシナプスの関連を検討するために、ミクログリアにGFPが発現しているIba1-GFPマウスと大脳皮質錐体細胞にGFPが発現しているthy1 GFPマウスを交配させた動物を作成し、大脳皮質シナプスに対するミクログリアの突起のアプローチを経時的に観察できる系を確立した。これにより、静止ミクログリアの動態とシナプスの関連が初めて明らかになりつつある。更に脳虚血作成技術を組み合わせ、障害時には、ミクログリアのシナプスに対する接触時間が飛躍的に延長することなど数々の興味深い成果が得られつつある。今後、シナプスのリモデリングに対するミクログリアの役割などについて、更なる検討を加え、得られる新たな知見を早期に論文として報告することが期待される。
この様に、生体恒常性機能発達部門では、抑制性シナプス結合の発達を in vitro及び、in vivoの両方において進める独創的な研究室であり、この分野で世界をリードする研究を行っている。in vivoイメージングは、世界的に見てもまだ黎明期にあり、多くの技術的困難を解決しなければならない。この様な開発の波の好機を捕らえて、今後は、in vitroの実験課題とin vitroの課題をより融合させ、個体から細胞・分子までのすべての階層に渡る研究が順調に進むことが期待される。
平成１９年１２月１日 河西 春郎
東京大学大学院医学系疾患生命工学センター教授