8 脳機能計測・支援センター

脳機能計測センターは、本年度より組織改変が行われ、形態情報解析室、生体機能情報解析室、多光子顕微鏡室、伊根実験室の4室で構成されることとなった。各室はそれぞれ超高圧電子顕微鏡、核磁気共鳴装置、2光子レーザー顕微鏡の管理・運用を行っている。これらは、大型機器であったり高度に専門的な管理が必要な機器であったりすることから、共同利用のために全国の大学の研究者に解放され、広く使用されている。毎年、公募されている共同利用実験や一般共同研究を通じて所外の研究者と所内の研究者との共同研究が活発に行われている。また、センターでは所内の共通利用のための組織培養室、ネットワークサービス、生体情報解析システムの運用を行っている。これらの共通業務のほか、各室の准教授、助教はそれぞれ独自の研究テーマを持ち、以下のような研究活動が行われている。

なお、伊根実験室は数年後には廃止が予定されており、現在、事務手続きを行っているところである。

8.1 形態情報解析室

形態情報解析室は、形態に関連する超高圧電子顕微鏡室(別棟)と組織培養標本室(本棟2F)から構成される。

超高圧電子顕微鏡室では、医学生物学用超高圧電子顕微鏡(H-1250M型;常用1,000kV)を、昭和57年3月に導入して同年11月よりこれを用いての共同利用実験を実施している。平成20年度は共同利用実験計画が27年目に入ったことになる。本年度も本研究所の超高圧電顕の特徴を生かした応用研究の公募に対して全国(外国を含む)から応募があり、合計13課題が採択されている。超高圧電子顕微鏡室では、共同利用実験計画を援助するとともに、これらの課題を支える各種装置の維持管理及び開発、医学生物学用超高圧電子顕微鏡に関連する各種基礎データの集積および電子顕微鏡画像処理解析法の開発などに取り組んでいる。

2008年10月には、京都工芸繊維大遠藤研究室との共同研究の論文(Nishida T et al., Three-dimensional, computer-tomographic analysis of membrane proteins (TrkA, caveolin, clathrin) in PC12 cells. Acta Histochem Cytochem 40:93-99, 2007)が日本組織細胞化学会論文賞を受賞している。マックス・プランク研究所ドレースデンとの共同研究では、哺乳類神経前駆細胞の細胞分裂期神経上皮細胞に関する研究成果(Kosodo et al. Cytokinesis of neuroepithelial cells can divide their basal process before anaphase. EMBO J 27:3151, 2008)を報告した。

電子線トモグラフィー手法に関しては、現在米国コロラド大で開発されたIMOD プログラムでの方法を用いて解析を進めており、川崎医大の樋田教授との共同研究でラット嗅球の顆粒細胞層に存在するアストロサイトの膜状構造が蜂の巣状構造に観察されることを3次元画像化した結果(樋田等, 超高圧電子顕微鏡による嗅球のニューロンとグリアの三次元構造解析. 顕微鏡 43:250-253, 2008)を報告している。また濱教授らによるゴルジ染色したラット大脳内アストロサイトのデータ(J Neurocytol 33:277-285, 2004; 2軸傾斜した一連の傾斜像)をIMOD プログラムにより、2軸トモグラフィー解析することができた。今後、解析精度との関連での研究成果が期待される。

組織培養標本室では古家園子助教による「メカノセンサーとしての小腸絨毛上皮下線維芽細胞に関する研究」が発展している。今年度は、小腸絨毛上皮下線維芽細胞の中間系フィラメントの発現がcrypt-villus axis に沿って異なっていることをヴィメンチン、デスミン、a-smooth muscle actinなどの各種モノクローナル抗体やポリクローナル抗体を用いて明らかにした。 %%%

形態情報解析室は、形態に関連する超高圧電子顕微鏡室(別棟)と組織培養標本室(本棟2F)から構成される。

生理学研究所に超高圧電子顕微鏡(H-1250M型)が、昭和57年(1982年)3月に導入されている。この超高圧電子顕微鏡は、1,000kV級の装置であり医学生物学用に特化した装置としては我が国唯一であるので、設置当初より全国に課題を公募して共同利用実験を行ってきた。平成20年度には、この全国共同利用実験の実施は27年目に入っている。現在、「生体微細構造の三次元解析」「生物試料の高分解能観察」「生物試料の自然状態における観察」の3つのテーマを設定している。本研究所の超高圧電顕の特徴を生かした応用研究の公募に対して全国から応募がある。平成20年度は「生体微細構造の三次元解析」に関連する課題が主であり、合計13課題が採択されている。この中で外国の研究者がメンバーとして正式に参加している課題は韓国から4件、米国から1件の計5件あり国際的にも利用されている装置である。今年度は、これまでに論文が2件報告されている。韓国啓明大学のもの1件、藤田保健衛生大学のもの1件である。

装置は、高真空度のもとに高い解像度を保って比較的安定に運転されている。設置以来の生理学研究所の超高圧電子顕微鏡の平均稼働率は、約80%である。全利用日数の約半分を所外からの研究者が使用している。今年度も9月末現在で、所外14日、所内32日の利用があり、平成20年度前期の稼働率は約50%である。

生理研に導入以来既に26年半が経過している。このため各部の劣化も進んでいる。また近年、医学生物学分野での超高圧電子顕微鏡研究者コミュニティの三次元断層撮影に対する強いニーズに応えていくためにも、近年の技術発展を取り入れた電子顕微鏡のデジタル化を進め、迅速で自動化されたデータ取得およびデータ解析を可能とすることも必要である。このような点を考慮すれば、今後、より一層成果を挙げていくためには、更新または、大規模な修理改造が必要である。

組織培養標本室では古家園子助手による「メカノセンサーとしての小腸絨毛上皮下線維芽細胞に関する研究」が発展している。今年度は、小腸絨毛上皮下線維芽細胞の中間系フィラメントの発現がcrypt-villus axis に沿って異なっていることをヴィメンチン、デスミン、a-smooth muscle actinなどの各種モノクローナル抗体やポリクローナル抗体を用いて明らかにした。

8.2 生体機能情報解析室

脳の「意志システム」や「運動システム」を神経回路レベルで解明することを目指して、サルの脳活動を大脳皮質フィールド電位記録法や陽電子断層撮影法を用いて解析する研究を行っている。

その一環として前頭葉シータ波活動についての研究を行った。ヒトの前頭葉周辺で観察されるシータ波はFrontal midline theta (Fmシータ) 波と呼ばれ、「注意集中」を要求される状況下でしばしば観察される。その発生領域や発生メカニズムなどの生理学的な基盤の解明が期待されるところであるが、ヒトを対象としてそれらを解明することは、侵襲的な実験が限られた状況下でしか許されないために、極めて困難である。当研究室では、この難点を克服するために、サルにおけるFmシータ波のモデルの作成を試みた。その結果、自発性運動課題を行うサルの前頭前野(9野)と前帯状野(32野)の大脳皮質フィールド電位に認められる特徴的なシータ波は、その周波数分布、空間分布、出現状況の類似性から、ヒトのFmシータ波に相同と考えて矛盾ないことを見出した(Tsujimoto et al. 2006)。サルのこの皮質領域は、先に報告した「やる気」に相関して局所脳血流変化を示す大脳皮質領域とも一致する(Tsujimoto et al. 2000)。この皮質領域が「注意」や「意志」のシステムに関係していると解釈して矛盾ない。さらに、この解釈の妥当性について別の運動課題(予告-命令刺激課題)においても検証し、肯定的な結果を得た(発表準備中)。また、このサルのモデルを用いて、シータ周波数領域での皮質間相互作用(皮質間結合の強度や情報の流れの方向性など)について研究を進めている。

また、運動野と感覚野による筋収縮制御についての研究を行った。一次運動野が近隣の運動関連領野と関係しながら筋収縮をコントロールしていることは一見当然とも考えられるにもかかわらず、その神経機構は十分には解明されていない。この点を詳解する目的で、サルの大脳皮質フィールド電位と上肢筋電図活動の記録及び解析を行った。その結果、大脳皮質一次運動野と一次体性感覚野のベータ波領域の活動が筋電図活動と有意な相関を示すことを確認した。さらに同じベータ波領域で運動野と体性感覚野の間の情報は双方向性に流れるが、後者から前者への流れが優位であることを見出した(学会発表Mima & Tsujimoto, 2008; 論文投稿中)。これは感覚野による運動のフィードバック制御にベータ波領域の神経活動が役立っている可能性を示唆する。

8.3 多光子顕微鏡室

多光子顕微鏡室では、多光子顕微鏡室、機能協関、生体恒常機能発達機構の各部門の個人研究および機構内連携プロジェクトで購入された機器を統一的に管理し効率的な運用を図る共に、研究所の内外への技術協力も行っている(技術相談、見学等20件以上)。多光子顕微鏡は、低侵襲性で生体および組織深部の微細構造および機能を観察する装置であり、近年国内外で急速に導入が進んでいるが、安定的な運用を行うためには高度技術が必要であるため、共同利用可能な研究機関は本室が国内唯一である。またこの学際的な新手法を普及させるため、研究所枠を越えた勉強会、セミナー等を定期的に実施した。専任の根本知己准教授のグループでは(1)非線形光学や光化学を活用した新しいバイオ分子イメージング手法の開発、(2)小胞輸送、開口放出・分泌現象などの分子細胞生物学的基盤とその生理機能の研究を中心に研究を推進している。以下、主な研究項目について述べる。

1. in vivoイメージング手法の展開

レーザー光学系の独自の改良により、生体脳において深さ約1 mmの構造を1μm以下の解像度で観察できる性能を実現した。生体内神経細胞のCa2+動態イメージング技術の確立および長時間連続イメージングのための生体固定器具の開発を行うとともに、同一個体・同一微細構造の長期間繰り返し観察技術の確立を行った(特許申請準備中。根本, ナノメデイシン; 根本, 薬学雑誌; Nemoto, Mol Cells)。

2. 生体肝代謝活性のin vivo測定法の開発

新たに2光子in vivo FRAP法の開発に成功し、麻酔下のマウス生体肝細胞における代謝活性を非侵襲的に定量することを可能とした(特許申請準備中)

3. リンパ節内の細胞運動のin vivoイメージング法の確立

麻酔下のマウスのリンパ節内部での蛍光標識を行った免疫細胞の運動を長期間観察する方法論を確立した。その結果、細胞接着因子とその上流のシグナル分子が動態に深く関与することが明らかになった(関西医大との計画共同研究。論文投稿中)。

4. 身体左右差獲得のCa2+イメージング

哺乳動物の身体の左右非対称性はノード流の一方向性に由来するが、その細胞生理学的な分子機構は不明である。そこで、マウス初期胚のCa2+イメージングからその分子機構を検討し、非対称なCa2+振動の存在が明らかになった(バイオ分子センサープロジェクト、基礎生物学研究所との共同研究)。

5. 新規蛍光タンパク質による1波長励起4波長蛍光同時測定システム

多光子顕微鏡の同時多重励起可能性を活用し、新しい短波長蛍光タンパク質を用いた4事象同時ライブイメージングのシステムを開発した。その結果、Ca2+とアポトーシスのDual FRETに世界で初めて成功した(北海道大学との計画共同研究、論文投稿中)。

6. 膵臓外分泌腺の開口放出における水チャネルの生理機能

東京医科歯科大腎臓内科グループの作成したAQP12ノックアウトマウスを用いて、水チャネルの開口放出における生理的な役割についてCa2+依存性開口放出の可視化解析による検討を行った結果、急性膵炎発症の初期過程と強く関係することが明らかになった(科学研究費特定領域研究、論文投稿中)

7. 膵臓ランゲルハンス島β細胞のインシュリン開口放出

GABA受容体と結合しリン酸脂質系の細胞シグナルに重要な役割を持つことが推定されてきた分子のノックアウトマウスの提供を受け、インシュリン開口放出の定量的な解析を実施したところ、cAMPを介してreadily releasable poolの制御を行っていることが明らかになった(九州大学との計画共同研究)。

8. マイクロチップレーザーによる多光子励起過程の検証

分子科学研究所平等グループの開発した超小型高出力の近赤外ピコ秒パルスレーザーの生体イメージングへの応用を検証するため、蛍光タンパク質等の多光子歴過程による活性化を試みた(機構内連携「レーザーバイオロジー」プロジェクト)。

9. ベクトルレーザービームによる超解像イメージング法の開発

新しい光ベクトルレーザー光を用いて、古典的な光の回折限界を打ち破る蛍光ナノイメージング法の開発に着手した(JST CREST)。

その他、グルコース輸送体の小胞輸送による生理機能制御、ノックアウト動物によるSNARE分子複合体の機能、光ファイバーを用いた多光子顕微鏡システムの開発などについても着手した。専属スタッフが准教授1名、技術課職員1名という現状では、今後の共同研究数の増加には対応することが困難であることが予想される。また超短パルスレーザー装置は、その大部分が科学研究費等の個人研究の予算によって購入されたものであるため、維持管理に要する予算の確保もまた大きな課題である。

8.4 伊根実験室

伊根実験室は生理学研究所の組織再編に伴い、脳機能計測・支援センター(柿木隆介センター長)に属することになった。柿木室長のもと、久木田が副室長として伊根実験室担当を兼務する形で運営管理の任務に携わっている。