2 分子生理研究系 ナノ形態生理研究部門(岡崎統合バイオサイエンスセンター)(永山國昭教授)の評価
2.1 Fred Sigworth教授 (アメリカ Yale大学)
2010年12月16日
評価対象：岡崎統合バイオサイエンスセンター ナノ形態生理部門
担当教授 永山國昭
評価委員：Frederick Sigworth, Department of Biomedical Engineering, Yale University
The Laboratory of Nanostructure Physiology, directed by Professor Nagayama, is engaged in a wide variety of projects at the interface between physical sciences and biology. Associated faculty members in the laboratory are carrying out work on the physiology of fluid secretion (M. Murakami), the mechanisms that sort membrane proteins in polarized cells (M. Ohashi), and advanced chemistry for DNA sequencing (M. Kataoka). The largest projects in the laboratory however involve advanced technologies for the imaging of biological specimens by means of electron microscopy. Advances in phase-contrast devices and their application to biological specimens have largely come from the intensive efforts of R. Danev, while Professor Nagayama himself is directing the development of two advanced electron microscopes.
Phase-contrast electron microscopy
Over the past five years the most significant advance in the laboratory has been the development of practical phase-contrast devices for electron microscopy (EM). Zernike phase contrast has been a fundamental technique in light microscopy for many decades, but the world’s only practical phase-contrast devices for EM have been developed in the Nagayama laboratory. The devices, consisting of a thin amorphous carbon film etched with an ion beam, have become practical only after numerous technical obstacles have been overcome by advances including the development of a heated holder and a carbon “wrapping” technique to minimize the effects of contamination. With these devices in place in suitably-modified electron microscopes, Dr. Danev has obtained images of unprecedented contrast and clarity from unstained biological specimens. Improvements are seen in single-particle reconstruction of macromolecular structures, but it appears that the most promising application of the technology is to electron cryo-tomography. The vastly-increased contrast makes cellular and viral structures visible for the first, and will greatly reduce the difficulty of segmenting the 3D reconstructed volumes of cells into different compartments and macromolecular structures. The work has been extremely productive, as publications on phase-contrast electron microscopy from the laboratory have numbered 27 in the past five years.
More technical improvement is still needed, as the useful life of a phase-plate device is quite limited, limiting the number of images that can be obtained. Research concerning contaminants and other mechanisms that produce electrostatic charging, and therefore degradation of phase-contrast images, is ongoing in the laboratory. Despite the shortcomings, the proof-of-principle stage has definitely been reached for phase-plate devices as applied to important biological problem. It appears that the technology will soon be ready for “reduction to practice” in industry and will be an extremely important feature of future electron microscopes for use with biological specimens.
Hybrid microscope
A well known problem in cell biology has been the need for registration of light-microscope and electron-microscope images. In the light microscope, fluorescent labels indicate structures and macromolecules of interest, typically labeled genetically or with antibodies. Electron-microscope images, on the other hand, have the resolution to identify single macromolecules and provide definitive information about their arrangement in the labeled structures. Prof. Nagayama has directed an effort that has resulted in the most successful solution to the registration problem that has been achieved to date. This is a hybrid microscope--a modified electron microscope in which its specimen can be observed in situ with an epifluorescence optical system as well as with the electron-optical system. Tradeoffs have been made—neither the EM nor the LM images are of the highest quality, with the most severe limitation being a relatively small numerical aperture of 0.42 for the LM optics. There is hope that the N.A. might be increased in a next-generation design. Nevertheless this instrument is an extremely important development for cell biology research, and in the future the resulting technology is likely to become widely used worldwide.
New high-voltage electron microscope
The second new technical advance is the linear-accelerator electron microscope. Electron tomography is, as mentioned above, a very important new technique for imaging the contents of cells at high resolution. A severe limitation however is limited electron penetration; with the 300 kV microscopes that are commonly used, specimens thicker than about 1 micron cannot be imaged. This thickness limit excludes all eukaryotic cell bodies and also excludes very important smaller structures such as synapses in the central nervous system. Higher-voltage microscopes exist, but these are extremely large instruments that require special multi-storey buildings to house them and which are not suitable for cryo-EM work. The idea being pursued in the Nagayama laboratory is to use linear-accelerator technology to accelerate electrons to 500 keV to pass through the specimen, and then to decelerate them again for high-efficiency imaging with an electronic detector. The very exciting result is a high-voltage microscope that is only about 1 meter taller than a conventional 300 kV microscope and would be much less expensive to build. Of particular interest is the possibility to scale such an instrument to 1 MeV or even 5 MeV with little increase in physical size.
The 500 kV microscope is now under construction. This project is definitely a high-risk endeavor. The requirements for a high-performance tomography microscope—high beam coherence, a small energy spread of a few parts per million, sub-nanometer stage stability—place severe constraints on the electron source and accelerator design, especially since the electron beam must be pulsed in synchrony with the accelerator drive power. It is unclear whether the thermal and mechanical requirements of the accelerator and decelerator, each requiring about ten kilowatts of RF power, will be compatible with the necessary stability. Nevertheless the instrument under construction will at minimum serve the purpose of identifying the key technical problems to be overcome in pursuing the very important goal of making higher-voltage microscopes available to the biological community.
Physiology of secretion
Dr. Murakami researches the mechanisms and control of secretion in the salivary gland. He has developed a robust experimental preparation that allows him to accurately measure secretion while controlling the content and flow of perfusate. He has used this system to characterize the transcellular and paracellular secretion pathways and has demonstrated their differential control by calcium and other agents. Through collaborations with other laboratories he has made use of advanced imaging modalities, and his work would be a natural application for electron tomography if it could be applied to thick (> 1 µm) speciments. Working with a student in his laboratory he has recently described the mechanism of a natural secretagogue that is known from Chinese traditional medicine. His recent selection to be chairman of the Gordon Research Conference shows that he is very well respected by workers in his field.
Cell polarity
Dr. Ohashi is researching the mechanisms by which individual cells express different sets of membrane proteins on different membrane surfaces. This “cell polarity” is an essential feature of epithelial tissues, where vectorial transport of solutes is realized. Less understood are the mechanisms for planar cell polarity (PCP) where variations in protein targeting occur along another axis. Dr. Ohashi's work concentrates on the signaling molecules that establish polarity in cells. His research program is focused on two goals. He is investigating the control of endocytosis that regulates tight junctions, and also the factors that allow membrane-traffic mechanisms to establish cell polarity. He has developed a novel genome-wide screen to label and identify molecules that are involved in specific membrane trafficking, and has started to identify candidates. Although the work is ambitious and labor-intensive, Dr. Ohashi has no other personnel in his laboratory. He therefore relies heavily on collaborations with other laboratories to allow the research to move forward.
DNA sequencing
Dr. Kataoka has been working on chemical modifications of DNA bases in support of new automatic sequencing technologies. He has developed reactions by which the four different bases can be specifically “augmented” by the insertion of variable numbers of hetrocyclic ring structures. The result is a size-labeling of bases in single-stranded DNA which may be useful in several DNA sequencing technologies, including nanopore-based methods and sequencing by AFM or electron microscopy. At present the various fluorescence-based sequencing methods appear to have leapfrogged these technologies; nevertheless the base-specific chemistries being developed by Dr Kataoka are likely to have other important applications.
(和訳)
永山教授に率いられているナノ形態生理研究部門は幅広い研究を物理と生物の境界領域で行っている。研究室にはその他水輸送生理学の村上、極性細胞の膜選別機構研究の大橋およびDNAシーケンサのための有機化学の片岡達がいる。その中で主力は電子顕微鏡を用いた研究である。R. Danevが位相差法機器開発とその応用の推進役であった。永山教授自身はこの他に2つの新規顕微鏡開発を指揮した。
位相差電子顕微鏡法
過去5年間の最重要研究は実用的位相差法の開発である。光学顕微鏡においてゼルニケ位相差法は基本装置だが電子顕微鏡においては永山グループが世界で唯一実用的装置を稼働させている。位相差法のデバイスである位相板は非晶質炭素膜をイオンビームで削孔し作られるが多くのノウハウが必要とされた。この位相板を適応的に整備された電顕にを用い、Danevにより素晴らしい無染色生物試料像が撮られている。立体像を再構成する一粒子解析法において良い結果を得られているが最大の期待は低温トモグラフィーへの応用である。位相差法により大幅に改善された高コントラスト像が3次元再構成を容易にしている。これらの一群の研究は大変生産的で過去５年間に27論文を生み出している。
ただし現行位相差法は未だ安定的でなくさらに開発の必要がある。ゴミ付着等々に伴う位相板帯電問題の解決である。いずれにせよ原理証明はできたのでこの手法は将来の生物電顕にとって重要手法となろう。
ハイブリッド顕微鏡}
細胞生物学では光顕と電顕の両者使われている。光顕では遺伝子タグや抗体タグによる蛍光法で対象の構造や生体高分子の存在が知られる。一方電顕では生体高分子を特定する分解能を持ち標識分子の決定的情報が得られる。永山教授はこの両者を実時間観察できる新しい手法の開発に成功した。このハイブリッド顕微鏡は生物試料の蛍光像と電子像を同時的に観察できる。もちろんお互いの性能を少しずつ削りあうというトレードが必要だがその欠点は僅少であり、将来の改良が期待される。この装置は細胞生物学にとって極めて重要で世界的に広く使われるようになるだろう。
新規超高圧電子顕微鏡
第2の電顕技術開発では線型加速器を利用した。先に述べたように位相差法トモグラフィーは有用だが、200 kVの加速電圧では充分厚い生物試料には対応できない。そのため真核生物細胞や神経シナプスのような大きな構造の直接観察ができない。超高圧電顕を用いれば厚い試料を扱えるがともかく巨大で不便であるし、また低温実験にも向かない。永山教授らはこの問題を加速器技術を用いることで突破し、現在500 kV電顕を作製中である。試料直前で加速し直後に減速する方法で実に通常電顕とほとんど変わらない大きさ(1 m高くなるだけ)の小型化装置を実現した。この手法は100万ボルト、500万ボルトの電顕にも拡張可能である。
現在調整中であり、多くのリスク（電子ビームコヒーレンス、電子源の制約、エネルギー広がり、試料有機物安定性、パルス電子化の問題、電源安定性）がある。熱的、振動的問題も未知である。そのような問題を抱えながらもこの装置はプロトタイプとして新手法の問題の所在を明らかにし、生物用超高圧電顕の将来を切り拓くことに寄与すると期待される。
分泌生物学
村上准教授は耳下腺の唾液分泌機構を研究している。分泌内容と分泌速度を制御したすぐれた実験装置を組み立て分泌の定量研究を行った。腺組織の縦方向、横方向の分泌通路を分離し両者の特性の差を見出している。外部共同研究者とともに各種イメージを撮っており、厚い試料なので電顕トモグラフィーの良いターゲットと言える。また中国からの大学院生とともに漢方薬の定量評価も行っている。耳下腺分泌問題の世界的第一人者としてGordon Research Conferenceの議長も務めた。
細胞極性
大橋助教は細胞表面の分子の局在化機構、「細胞極性」問題を研究している。特に上皮細胞で極性は重要で溶解物のベクター輸送をとりしきっている。現在未知な部分は縦方向でなく隣り合う横方向の極性生成機構（PCP）で、蛋白質局在の新規問題を提起している。彼はタイトジャンクションにおけるエンドサイトーシス制御を調べるためゲノムワイドのスクリーニングを行いPCPに関与する蛋白質候補をつり上げた。大変野心的で骨の折れる研究だが研究室では単独で行っており協力は専ら外部共同研究者との間で行われている。
DNAシーケンシング
片岡助教はDNAシーケンシングのためのDNA修飾、特にDNA塩基に修飾を導入し、塩基の複素還数を変え4塩基の弁別を可能にする有機化学的方策を研究している。一重鎖DNAにこうしたサイズ的標識を行えば色々なシーケンシング法、AFMや電顕に有効だろう。現行では種々の蛍光標識法がDNAシーケンシングに飛躍をもたらしているが片岡の方法も何か重要な応用を見出すはずである。
2.2 難波啓一 教授 (大阪大学 大学院 生命機能研究科)
2010年12月16日
評価対象：岡崎統合バイオサイエンスセンター ナノ形態生理部門
担当教授 永山國昭
評価委員：大阪大学大学院生命機能研究科 教授 難波啓一
ナノ形態生理部門では主として3つのグループがそれぞれ研究活動を推進している。永山國昭教授はDanev Radostin助教および片岡正典助教とともに、位相差電子顕微鏡の開発とその応用による、生体分子、ウイルス、細胞、生体組織の観察技術や、DNA塩基配列高速解析基盤技術の開発を目指している。村上政隆准教授は唾液腺による唾液分泌メカニズムの研究を、大橋正人助教のグループはエンドサイトーシス経路を中心とした細胞内膜系生理機能の研究を進めている。これら3つのグループがお互いに協力しながらも、比較的独立に研究を実施していることが特徴である。
永山教授の発案による位相差電子顕微鏡開発については、その理論的裏付けと有効性が数十年前に提唱されたものの、実質的に使える装置として開発が行われたのはこのグループによる開発研究が世界で初めてである。このグループの開発した位相差電子顕微鏡の一つは、中心に約1ミクロン径の穴の空いたカーボン薄膜を位相板として用いるもので、それを対物レンズのバックフォーカルプレーンに置くことにより、試料を透過した電子線は位相を変えず、試料で散乱された電子線のみ位相をずらせることが可能である。通常のサイン関数型コントラスト伝達関数をコサイン関数型に変換し、像の低空間周波数成分の振幅をほぼゼロから1にすることで、結果として10〜20倍ものコントラスト増強が得られるというものである。それにより、生体試料観察に通常必要なunderfocusによる低空間周波数成分のコントラスト増強が必要なくなり、just focusに近い条件で像観察が可能になるため、コントラスト伝達関数による空間周波数依存の位相反転や振幅の減衰など、高分解能での像観察に望ましくない効果を除去できるという画期的な技術である。また、電子線照射損傷をできる限り抑えるために極めて低い電子線量で観察しなければならない生体試料の電子顕微鏡像では、その極めて低いコントラストとS/Nが、画像解析による立体像解析の分解能を低く留めている大きな原因であるため、位相差観察による低空間周波数領域のコントラスト増強は、高分解能での立体構造解析にとっても大きな助けになることが期待される。事実、このグループによる位相差電子顕微鏡の研究開発が刺激となり、ここ数年は国外でも複数の研究グループが様々な方式で位相差電子顕微鏡の開発を進めている。しかし、それぞれにまだ多くの問題を抱えており、このグループによる技術が実用に最も近い。インフルエンザウイルスを含む非対称なウイルスや細菌の立体像観察等で多くの成果を生み出しつつ、別の方式ではヒルベルト微分コントラストも実現し、細菌などの細胞内微細構造観察に威力を発揮して、これまで見えていなかった微細構造とその元素分布までを視覚化できるまでに進歩した。細胞レベルの微細構造を観察する研究者にとってはこれほど有効な観察技術はなく、広い研究分野での応用が期待される。
ただし、永山グループの作る電子線用位相板も、その本格的な実用化にはまだ大きなバリアがある。ナノテクノロジー分野でさまざまな技術が発達し、FIB(集束イオンビーム)による微細加工技術が進歩したため、カーボン薄膜の位相板も再現性よく作成可能になったが、実際のところ良い位相板の作成には特殊な職人技的ノーハウが必要とのことで、残念ながら安価に量産するレベルには至っていない。ただし、最近の位相板の性能安定性はかなり高くなっているとのことで、汎用技術としての発展が楽しみである。ここで言う良い位相板とは、帯電などによる像の揺れや歪みが起こらないもので、そのため位相板は鏡体内で常に高温加熱してあり、コンタミネーションを防ぐ工夫がされている。最近になって、帯電を起こす原因が、位相板を指示する金属グリッドのモリブデンと電子顕微鏡体内に残存する水分子が反応してできる酸化物であることが判明し、それを解決すべくさまざまな工夫を積み重ねているとのことである。カーボン薄膜を使わず、磁場や電場による位相シフトを利用した方式も検討および試作されており、今後の展開が楽しみである。
永山グループはまた、ここ数年の科学技術振興機構CRESTプログラム「生命現象の解明と応用に資する新しい計測・分析基盤技術」（領域総括：柳田敏雄）の支援により、光学顕微観察と電子線顕微観察を同時に実施することができる電子顕微鏡の開発を行った。それぞれの分解能や像質は必ずしも高くはないが、生体試料を電子顕微鏡の試料ステージに装着したままで光学顕微観察もできる装置であり、生命現象の解明に役立つ装置としてのポテンシャルを秘めている。
前述のとおり、永山グループはこの位相差電子顕微鏡を用いてDNAの塩基配列を高速かつ並列に読み出すための研究開発も推進しており、そのための塩基判別用プローブの開発や、DNA塩基の改変技術開発も進めている。テラベースと名付けたベンチャーを起こして積極的に研究開発を推進していることは高く評価できるが、このプロジェクトの成否に関しては、前途にたちはだかる高度な技術的困難を今後どれだけ解決できるか次第である。近年の次世代DNAシークエンサーの高速化には目を見張るものがあり、一分子蛍光観察技術を応用した装置では、近い将来ヒトゲノムのDNA配列を十数分で解析することが可能になるとすら言われている。位相差電子顕微鏡でそれを越える技術を実現することが可能かどうか、今後のチャレンジに期待したい。
2.3 曽我部正博 教授 (名古屋大学 大学院 医学系研究科)
2010年12月16日
評価対象：岡崎統合バイオサイエンスセンター ナノ形態生理部門
担当教授 永山國昭
評価委員：名古屋大学大学院医学系研究科 細胞生物物理学 教授 曽我部 正博
村上グループは主なテーマとして唾液腺の分泌機構の解明を目指している。これまでに生理学/生物物理学的手法による定量的研究に加えて解剖学や分子生物学的手法を組み合わせて、唾液分泌の浸透圧調節に主要な役割を果たす水輸送における経細胞輸送(transcellular transport)と傍細胞輸送(paracellular transport)の寄与を解析してきた。その結果、前者が主要であるとのこれまでの常識を覆して、tight-junctionを経由する傍細胞輸送が約70%を占めるという画期的発見を行った。最近5年間では、この傍細胞水輸送におけるアクアポリン-5(AQP5)の関与を発見し(2005)、さらに分泌細胞の側底膜に発現するAQP5が浸透圧センサーとして働くことで傍細胞水輸送を調節している可能性を突き止めた(2006)。この成果を含みこの5年間に計6編の原著論文を発表しているが、その中でも興味深いのは、ある種の漢方薬が直接耳下腺に作用して唾液分泌を促すという発見である(2009)。この成果は、その副作用の少なさから口腔乾燥症の新しい治療薬として使える可能性が高く、同病で悩む人々にとって大きな朗報であろう。
村上博士は一貫して唾液分泌の細胞分子機構を生理学、生物物理学、分子生物学の手法を駆使して研究を継続し、この分野の進歩に確実な実績を築いてきた。その実績は専門家からの高い評価を受けており、本年(2011)の唾液腺・内分泌生物学ゴードン会議の代表者に選出されている。准教授という立場上大きなチームを形成することは難しかったと推察されるが、研究所として氏の研究展開をバックアップする何らかの施策を講じると共に、ご本人も積極的に大型グラント確保に努力され、本研究の一段の発展を図ることを期待したい。
大橋グループは、エンドサイトーシス経路を中心としたメンブレントラフィックによる細胞増殖、分化におけるシグナル統合機構の解明を目指している。最近は、エンドサイトーシス経路が，ゴルジ体や細胞膜への外向き輸送と，消化器官であるリソソームへの内向き輸送間を選別するという方向性を有することに着目し、その解析を通して細胞極性の形成機構を解明することを主要な目標に設定している。過去5年間に4編の原著論文を発表しているが、注目すべき結果の一つは、細胞膜の受容体膜タンパク質がエンドソームからゴルジへ搬送されるのにコレステロールが必要なこと、コレステロールを供給する合成酵素が細胞内脂肪滴表面に存在して後期エンドソーム選別機能に何らかの役割を果たしていること、エンドソームの運動性とコレステロールの輸送がコレステロールの細胞内プールに依存することなどの発見であろう(2006)。これを元に、細胞内脂肪滴が単なる貯蔵庫ではなく、その表層が代謝・輸送および細胞内膜系の分子選別まで制御するプラットフォームであるという斬新なモデルを提案している。最近ではエンドソーム－ゴルジ細胞内膜系マーカー分子の、FL-REX (fluorescence localization-based retrovirus-mediated expression cloning)法による探索・同定を目指してエンドソーム－ゴルジ細胞内膜系様の局在を示す細胞をクローン化し、これを用いてマーカー候補分子の中に、発生における形態形成シグナル制御関連分子が含まれることなどを見出しており、今後の発展が期待される。発表された論文は何れも質は高いが、大橋博士の寄与度が明瞭ではない点が多少気がかりである。是非とも筆頭著者で独創性の高い論文の出版を目指してほしい。
以上、ナノ形態生理部門をサイトビジットし、部門を構成する3つのサブグループの特に最近5年間の研究成果と今後の展開についてヒアリングを行い、評価者の率直な印象を記述した。永山グループは教授の定年を控えているために今後の展開はやや不透明であるが、あと一歩で装置の実用化が見えている現在、研究所としては世界に誇れるその貴重な成果が実を結ぶように何らかの方策をとられるよう期待したい。他の2つのサブグループも重要な生理学的課題を着実にかつ興味深く展開しているので、その財産が生かされて今後十全な展開ができるように援助されることを望みます。
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