2005年9月1日−9月2日
代表・世話人：井上 和秀（九州大学 大学院 薬学研究院）
所内対応者：井本 敬二（神経シグナル）
- （１）
- 発生期海馬神経回路形成と細胞外ATP
加藤 総夫1，山岡 正慶1,2，川村 将仁1,3
（1慈恵医大・神経生理，2同・医学部6年，3現所属：同・薬理第1）
- （２）
- パーキンソン病治療薬としてのアデノシンA2Aアンタゴニスト
森 明久（協和発酵工業（株）・医薬研究開発本部）
- （３）
- 脊髄痛覚伝導における血小板活性化因子(PAF)の役割−ATP，グルタミン酸，cGMPの関与−
土肥 敏博，森田 克也，森岡 徳光，北山 友也
（広島大学 大学院 医歯薬学総合研究科 病態探究医科学講座歯科薬理学）
- （４）
- 細胞外ATPによるミクログリア遊走能の調節機構
大澤 圭子，本田 静世，佐々木 洋1，入野 康宏，中村 泰子，井上 和秀2，高坂 新一
（国立精神・神経センター 神経研究所 代謝研究部
1Department of Pathology and ImMunology,
Washington University School of Medicine
2九州大学大学院 薬学研究院 薬効解析学分野）
- （５）
- Comparative analysis of physical
dimensions of the pore of maxi-anion, VSOR and CFTR chloride channels as
putative ATP-channels
Ravshan Sabirov1,2 and Yasunobu Okada2
(1Dept.
of Biophysics, National University of Uzbekistan, 2Dept. of Cell
Physiology, NIPS)
- （６）
- 毛髪生理におけるアデノシンの作用機構
岩渕 徳郎1，中沢 陽介1，飯野 雅人1，江浜 律子1，尾郷 正志1，田島 正裕1，荒瀬 誠治2
（1資生堂リサーチセンター，2徳島大医）
- （７）
- マウス網膜P2Xプリン受容体を介する情報処理はON経路とOFF経路で異なる
金田 誠，石井 俊行*，重松 康秀**，細谷 俊彦*，霜田 幸雄**
（慶應大・医・生理，理研・脳センター・細谷研究ユニット*，東京女子医大・総研**）
- （８）
- 内皮細胞のATPレセプターP2X4を介した血流センシング
山本 希美子，曽我部 隆彰，安藤 譲二
（東京大学 大学院 医学系研究科 医用生体工学講座システム生理学）
- （９）
- P2Y受容体刺激による前駆脂肪細胞のadipogenic
hormonesに対する感受性増大
尾松 万里子，松浦 博（滋賀医科大学・生理学講座・細胞機能生理学部門）
- （10）
- 脳血管内皮細胞におけるATPによる新規Ca2+増幅機構の解明
山崎 大樹1，大矢 進1，村木 克彦2，浅井 清文3，今泉 祐治1
（1名古屋市大院・薬・細胞分子薬効解析，
2愛知学院大・薬・細胞薬効，3名古屋市大院・医・分子神経生物）
- （11）
- レチノイン酸による初代培養ミクログリアのP2X4受容体発現増強
戸崎 秀俊1,2，津田 誠1，小泉 修一2，井上 和秀1
（1九州大学 大学院 薬学府，2国立衛研薬理部）
- （12）
- 後根神経節細胞における細胞質型ホスホリパーゼA2のATPによる活性化
長谷川 茂雄，津田 誠，井上 和秀（九州大学 大学院 薬学府 薬効解析学分野）
- （Ｐ１）
- 免疫担当細胞におけるP2X7受容体機構の解析
月本 光俊，原田 均，五十里 彰，高木 邦明，出川 雅邦（静岡県立大・薬）
- （Ｐ２）
- BradykininによるATP放出への多剤耐性MRPの関与の可能性
趙 玉梅，佐藤 千江美，右田 啓介，桂木 猛（福岡大・医・薬理）
- （Ｐ３）
- P2X受容体反応に及ぼすパーキンソン病原因遺伝子parkinおよびalpha-synucleinの影響
有村 由貴子1，佐藤 あゆみ1，西川 香里2，青木 公三子2，和田 恵津子2，
青木 俊介2，和田 圭司2，野田 百美1（1九州大・院・薬・病態生理，
2国立精神・神経センター・神経研・疾病研究第4部）
- （Ｐ４）
- コレステロール代謝変動に起因するミトコンドリア機能障害と神経細胞変性過程
道川 誠（国立長寿医療センター研究所 アルツハイマー病研究部）
- （Ｐ５）
- Shear Stress Induced Ionic Current and FM1-43
Influx via P2X4 ATP-receptor as a Mechano-transduction Pathway
Fernando Lopez-Redondo1,
Kimiko Yamamoto2, Joji Ando2, Kishio Furuya1,
Kumi Akita1, Keiji
Naruse1,3, Masahiro Sokabe1,3,4
(1Cell
Mechanosensing, SORST, JST; 2Dept Biomed Engin, Grad Sch Med, Univ
Tokyo;
3Dept Cell Biophysics, Grad
Sch Med, Nagoya Univ; 4Dept Mol Physiol, Natl Inst Physiol Sci)
- （Ｐ６）
- マウス脳内のアデニン類含量およびアデニル酸シクラーゼの内因性阻害物質
3’-AMP産生酵素系に及ぼす加齢の影響
藤森 廣幸，宮本 晃洋，堀内 隆宏，芳生 秀光（摂南大・薬・衛生分析化学）
- （Ｐ７）
- アシドーシスによる新生ラット摘出脊髄反射電位の抑制作用におけるアデノシンの関与
乙黒 兼一，山地 良彦，伴 昌明，太田 利男，伊藤 茂男
（北海道大学 大学院獣医学研究科 薬理学教室）
- （Ｐ８）
- アストロサイトにおける酸化ストレスによる細胞死誘導シグナリングに対するP2Y1受容体活性化の拮抗作用
篠崎 陽一1，小泉 修一1，井上 和秀2（1国立衛研・薬，2九州大・薬・薬効解析）
- （Ｐ９）
- 脊髄後角の興奮性シナプス伝達に及ぼすアデノシン作用におけるヌクレオシド輸送体の役割
柳 涛，藤田 亜美，中塚 映政，熊本 栄一
（佐賀大学医学部生体構造機能学講座神経生理学分野）
- （Ｐ10）
- P2Y受容体刺激による細胞膜PtdIns(4,5)P2の一過性の減少
藤居 祐介，尾松 万里子，松浦 博（滋賀医科大学・生理学講座・細胞機能生理学部門）
- （Ｐ11）
- 感覚神経終末グリア網におけるカルシウム波伝播の二重様式とプリン受容体の関与について
岩永 ひろみ（北海道大学 大学院 医学研究科 組織・細胞学分野）
- （Ｐ12）
- アデノシン刺激によるMDCK細胞からのATP放出に対するシグナリングおよび放出部位の検討
右田 啓介，趙 玉梅，桂木 猛（福岡大・医・薬理）
- （Ｐ13）
- 骨髄間質細胞のP2Y2受容体を介したカルシウムシグナリングは細胞密度に依存して変化する
市川 純，玄番 央恵（関西医科大学・第2生理）
- （Ｐ14）
- 末梢神経損傷後におけるP2X受容体の後根神経節での変化
小林 希実子，福岡 哲男，山中 博樹，野口 光一（兵庫医科大学・解剖学第2講座）
- （Ｐ15）
- 血管周皮細胞ペリサイトに発現するP2受容体とその機能
藤下 加代子1，末石 浩二1,2，井上 和秀3，小泉 修一1
（1国立衛研・薬理部，2福岡大学・薬・薬学疾患管理，3九州大学・院・薬・薬効解析）
- （Ｐ16）
- アストロサイトのpinocytosisにおけるP2Y6受容体の関わり
多田 薫1，戸崎 秀俊1，井上 和秀2，小泉 修一1
（1国立医薬品食品衛生研究所 薬理部，2九州大学 大学院 薬学研究院 薬効解析学分野）
- （Ｐ17）
- Regulation of purinergic P2X2
receptor activity by phosphoinositides
藤原 祐一郎，久保 義弘（生理研 神経機能素子）
- （Ｐ18）
- ATPgSによるアストロサイトでのMCP-1産生誘導におけるMAPキナーゼカスケードの役割
片山 貴博，南 雅文（北大院・薬・薬理学分野）
【参加者名】
井上 和秀（九州大学），片山 貴博，岩永 ひろみ，乙黒 兼一（北海道大学），松岡 功（福島県立医科大学），山本 希美子（東京大学），霜田 幸雄（東京女子医科大学），繁冨 英治，安井 豊，山本 清文，池田 亮，井村 泰子，河野 優，加藤 総夫，川村 将仁（東京慈恵会医科大学），須藤 久美（昭和大学），大澤 圭子（国立精神・神経センター 神経研究所），末石 浩二，大久保 聡子，小泉 修一，酒見 和枝，篠崎 陽一，多田 薫，藤下 加代子（国立医薬品食品衛生研究所），山田 千晶（共立薬科大学），金田 誠（慶應義塾大学），森 明久（協和発酵工業（株）），岩渕 徳郎（資生堂リサーチセンター），安田 昌弘（エーザイ株式会社），三原 拓真（アステラス製薬株式会社），平手 謙二，今井 利安，佐久間 詔悟（日本ケミファ（株） 研究所），月本 光俊（静岡県立大学），原田 均，志内 伸光，尾崎 紀之，篠田 雅路，杉浦 康夫（名古屋大学），古家 喜四夫（科学技術振興機構），Lopez-Redondo
Fernando（科学技術振興機構），道川 誠（国立長寿医療センター研究所），山崎 大樹（名古屋市立大学），山田 善也（ファイザー），尾松 万里子，藤居 祐介（滋賀医科大学），山下 勝幸（奈良県立医科大学），藤森 廣幸，堀内 隆宏，宮本 晃洋（摂南大学），市川 純（関西医科大学），小林 希実子，野口 光一（兵庫医科大学），土肥 敏博（広島大学），有村 由貴子，上野 光，津田 誠，戸崎 秀俊，豊満 笑加，永田 健一郎，中村 康次，野田 百美，長谷川 茂雄，藤田 拓美，山村 悠介（九州大学），趙 玉梅，桂木 猛，右田 啓介（福岡大学），熊本 栄一，中塚 映政，藤田 亜美，柳 涛（佐賀大学），秋葉 光雄，中村 宣司（浅井ゲルマニウム研），Sabirov Ravshan（タシュケント大学（ウズベキスタン）），島 麻子（統合バイオ），岡田 泰伸，久保 義弘，藤原 祐一郎，北村 明宏，Amal
K.Dutta，Hongtao Liu，曽我部 隆彰，井本 敬二（生理研)
加藤 総夫1，山岡 正慶1,2，川村 将仁1,3
（1慈恵医大・神経生理，2同・医学部6年，3現所属：同・薬理第1）
中枢神経系の重要な機能原理は「自己組織化」である。特に，神経回路の形成過程において，適切なニューロン間の適切なシナプス結合の形成には，内因性に形成される自動的かつ自発的な神経活動によって活性化される諸分子群の相互作用が重要な役割を担うことが知られている。このような組織化された自発性な活動の存在は，発生期のみならず成熟後の動物の極めて広範な中枢神経系局所回路において報告されている。
海馬からは，theta-wave，delta-wave，ripple wave，sharp waveなどのさまざまな種類の自発的周期的活動パターンが記録される。これらの組織化された活動はそれぞれ固有の機構によって発生し，独自の生理学役割を担うと考えられている。特に，胎生〜周生期におけるCA3領域の神経回路は，(1)興奮性主細胞間の反回性（反響性）興奮結合，および，(2)高細胞内Cl-濃度に起因するGABA作動性介在ニューロンを介した自己興奮性シナプス，の両機構によって，自発的かつ周期的に生じるニューロン群の同期的興奮性活動（一般にgiant depolarizing potential, GDPと呼ばれる周期的膜電位変動パターンとして観察される）を示す。このGDPは，興奮性活動として海馬全域に伝播し，海馬のシナプス・ネットワークの形成において中核的役割を担う可能性が示されている(Nat Rev Neurosci 3:728-, 2002; J
Physiol 559:129-, 2004)。
現在までに，中枢神経系の広範な領野においてP2受容体の発現が報告され，それらの多くにおいて，外因性のATPの投与によって誘発される特異的な生理的応答が証明されてきた（例：J
Physiol 530: 469-, 2001; J Neurosci 24: 3125-, 2004）。また，実験的な刺激や，薬物の投与によって生じる内因性ATPの放出と，それによって誘発されるP2受容体活性化を介した生理的応答も報告されてきた(J Neurosci
23: 7426-, 2003)。しかし，nativeな脳組織の中で自発的かつ自動的に形成されるダイナミックな活動の形成に内因性のATPとそれによるP2受容体の活性化が関与している事実を証明した報告はほとんどない。
我々は，海馬CA3領域のGABA作動性介在ニューロンが興奮性コンダクタンスと共役したP2Y1受容体を発現し，外因性に投与したATPもしくはADPがこの受容体の活性化を介して抑制性ニューロンの興奮性を亢進させ，その結果，錐体細胞へのGABA作動性入力が増加するという事実を，生後7-15日のラットおよびマウスを用いて報告した(J Neurosci 24:
10835-, 2004)。この事実に基づき，新生期海馬CA3ネットワークにおいて特異的に観察されるGDPの形成に，内因性のATP/ADPとそれらによるP2Y1受容体の活性化が関与するという仮説を立て検証した。
2-8日齢のWistar ratの急性海馬スライスCA3錐体細胞からパッチクランプ法ならびに共焦点顕微鏡によるFluo-4蛍光imaging法を用いて，自発，および，苔状線維刺激誘発GDPを記録した。一部の例ではATP biosensorを用いた局所的細胞外ATP濃度の測定を行った。特異的P2Y1受容体遮断薬，脱感差性P2Y1受容体作動薬，apyraseなどの投与，および，潅流速度の変化などによるGDPの発生頻度および活動パターンの著明な変化から，自発的・周期的GDP活動の形成に内因性のATP/ADPが関与すると結論した。
森 明久（協和発酵工業（株）・医薬研究開発本部）
これまでにアデノシン受容体には，A1，A2A，A2B，A3の4種類のサブタイプが存在することが報告されている。このうち，アデノシンA1，A2B，A3受容体が脳全域に広範に分布するのに対し，アデノシンA2A受容体は大脳基底核を中心として，線条体，淡蒼球，側坐核，嗅結節に高密度に局在することが明らかになってきた。このことから，大脳基底核を介する機能，例えば運動や精神機能の調節に，アデノシンA2A受容体が重要な役割を果たすのではないかと考えられている。特に興味深いことは，アデノシンA2A受容体が，線条体からの出力路の一つ，線条体-淡蒼球経路（間接路）を構成するGABA作動性中型有棘神経細胞(Medium spiny
neuron(MSN))に特異的に発現していることである1。
本発表では，協和発酵工業株式会社にて創製された選択的アデノシンA2AアンタゴニストKW-6002の抗パーキンソン病作用などの薬効薬理2を中心に，アデノシンA2Aアンタゴニストが，代表的な大脳基底核疾患の一つであるパーキンソン病の治療薬になる可能性を紹介する。加えてMSNにおけるアデノシンA2A受容体の生理的役割と大脳基底核回路を介した運動制御への寄与について，これまでに得られている電気生理学，神経化学的成績などを基に，アデノシンA2Aアンタゴニストの抗パーキンソン病作用の作用機序3についても紹介する。
1.Schiffmann
SN, Jacobs O., Vanderhaeghen JJ. Striatal restricted adenosine A2 receptor
(RDC8) is expressed by enkephalin but not by substance P neurons: an in situ
hybridization histochemistry study. J Neurochemstry 1991;57:1062-7.
2.Jenner
P. A2a antagonists as novel non-dopaminergic therapy for motor dysfunction in
PD. Neurology 2003;61(11
Suppl 6):S32-8.
3.Mori
A, Shindou T. Modulation of GABAergic transmission in the striatopallidal
system by adenosine A2A receptors: a potential mechanism for the
antiparkinsonian effects of A2A antagonists. Neurology 2003;61(11 Suppl 6):S44-8.
土肥 敏博，森田 克也，森岡 徳光，北山 友也
（広島大学 大学院 医歯薬学総合研究科 病態探究医科学講座歯科薬理学）
血小板活性化因子(Platelet-Activating Factor:
PAF)は，ウサギ好塩基球由来の血小板凝集因子および腎髄質由来の降圧物質として発見されたリン脂質である。現在まで，PAFは多くの組織で産生され，炎症・免疫系細胞の活性化，強い血管透過性亢進作用や気管支収縮作用を有し，さらに妊娠・分娩，循環，虚血等による組織障害への係わりなど，実に多彩な生理・病態生理のリン脂質性メ
ディエーターであることが明らかにされてきている。
繰り返される疼痛刺激や神経損傷時に痛覚感作が生じる。これには，侵害刺激に対する痛覚の増大，すなわち，痛覚過敏(hyperalgesia)，と正常では非侵害性の機械的刺激に対して痛み反応を生じるアロディニア（メカニカル・アロディニア）がある。プロスタグランジン類(PGs)は末梢における重要な炎症・疼痛反応のメディエーターである。一方，PAFはPGE2よりも強い浮腫を引き起こすのに対し，末梢組織における痛覚感作は極めて弱い。近年，PGE2は末梢のみならず，脊髄での痛覚過敏ならびにアロディニア発現において重要な役割をはたしていること，またそのメカニズムは末梢とは異なることが示されている。脊髄PAF濃度は脊髄損傷時に上昇し，脊髄炎症性二次障害のメディエーターではないかと推察されている。しかし，脊髄における痛覚伝導におけるPAFの役割は明らかではない。本研究では，脊髄におけるPAFの疼痛制御における役割について検討し，PAFは脊髄腔内投与によりアロディニアと熱刺激に対する痛覚過敏を引き起こす事を認めた。
a，b-methylene ATPの脊髄腔内投与はアロディニアを誘発した。PAF誘発アロディニアはATP受容体拮抗薬PPADS，TNP-ATPにより抑制された。PAFは培養後根神経節細胞からATP遊離を促進した。各種阻害薬を用いた結果から，PAF受容体刺激によるATP，グルタミン酸の遊離，NO産生- cGMP-PKGカスケードがアロディニア発現に関与することが示された。 PAF誘発アロディニアや痛覚過敏にカプサイシン感受性神経が介在する可能性が示唆された。PAFの脊髄腔内投与により脊髄後角表層に活性化ミクログリアの集積が認められた。ミクログリアの抑制作用を有するミノサイクリンはPAFによるアロディニアの誘発を抑制した。siRNAによりグリシン受容体サブタイプGlyRa3ノックダウンマウスにおいてPAF誘発アロディニアの，特に持続相が抑制され，cGMPアナログ8-p-CPT-cGMPの脊髄腔内投与によるアロディニアは初期から抑制されたことより，PAF誘発アロディニアの持続相にcGMP/PKGによるグリシン受容体機能の抑制が関与する可能性が示唆された。グリシントランスポーター阻害作用を有する薬物に抗アロディニアならびに鎮痛作用が認められた。
以上のことより，PAF誘発アロディニアに，PAF受容体刺激によるATP，グルタミン酸の遊離，NO産生-cGMP-PKGカスケードが関与し，cGMPはグリシン受容体機能を抑制して抑制系を脱抑制し，このことがアロディニア発現に関与する可能性が示唆された。また，この過程に活性化ミクログリアが重要な係わりを有することが示唆された。更に，グリシントランスポーター阻害作用を有する薬物に抗アロディニアならびに鎮痛作用が認められた。今後ATP-グリシン系の解析，またグリシントランスポーター阻害薬の鎮痛薬としての有用性について更なる検討の予定である。
大澤 圭子，本田 静世，佐々木 洋1，入野 康宏，中村 泰子，井上 和秀2，高坂 新一
（国立精神・神経センター 神経研究所 代謝研究部
1Department of Pathology and ImMunology,
Washington University School of Medicine
2九州大学大学院 薬学研究院 薬効解析学分野）
ミクログリアは神経変性疾患や神経損傷時に反応性に活性化され，様々な生理活性物質の産生・放出や貪食などを行うことから，組織修復に積極的に関与する細胞であると考えられている。正常脳のミクログリアは長く多数に分岐した突起を持つラミファイド型であるが，障害時に速やかに反応して形態変化し，障害部位へ移動・集積する。従って，形態変化や遊走能の制御機構を研究することは，ミクログリアの活性化機構を理解し脳内機能を明らかにするために極めて重要である。
近年，ATP刺激によりミクログリアの様々な生理活性因子（プラスミノーゲン，IL-1b，TNF-a，IL-6，NOなど）の産生，放出能が促進されることが報告され，ATPがミクログリアの機能を調節する分子であることが明らかにされつつある。我々はATPがミクログリアの走化誘導因子になることを見出し，ATPによるミクログリア運動能の調節機構について研究してきた。本研究会では，ATPがミクログリアに発現するATP受容体P2Y12を介して遊走能を亢進すること，また，ATP刺激によるミクログリア遊走の調節に関わる細胞内情報伝達系を最近得られた知見とともに紹介したい。
ラット初代培養ミクログリアは，ATPやADPの刺激により膜ラッフルを形成し，ダンチャンバー内でATP濃度勾配に依存した細胞遊走を示した。膜ラッフル形成と細胞遊走は百日咳毒素やP2Y12特異的阻害剤AR-C69931MXにより阻害された。これらの結果から，ATPはP2Y12を介して遊走能を亢進することが明らかになった。そこで，ラット脳におけるP2Y12の発現をin-situ hybridizationで調べたところ，P2Y12の発現は，ミクログリア特異的タンパク質であるIba1発現細胞に認められ，脳実質内ミクログリアに局在していた。一方，三量体Gタンパク質(Gi/o)共役型受容体の下流では，ホスホリパーゼC(PLC)とホスファチジルイノシトール3キナーゼ(PI3K)が活性化されることが知られている。そこで，ATP刺激による膜ラッフル形成と細胞遊走に対する各シグナル分子特異的な阻害剤の影響を調べたところ，PLC阻害剤は膜ラッフル形成及び細胞遊走の両者を抑制した。一方，PI3K阻害剤は膜ラッフル形成を抑制しないが細胞遊走を阻害した。これらの結果から，ATP刺激直後に生じる膜ラッフル形成とその後の細胞遊走を調節するシグナル経路が異なり，PI3Kシグナル系は細胞移動の持続性や方向性の調節に関わると考えられる。さらに，PI3Kシグナル系の活性化をAktのリン酸化を指標として調べたところ，リン酸化Aktの増加は細胞外カルシウムの除去により抑制された。ミクログリアにはイオンチャネル型ATP受容体P2Xサブタイプも発現していることから，P2Y12に加えP2XがPI3K/Aktシグナル系を調節し細胞遊走に関与する可能性が示唆され，現在，検討中である。
Ravshan Sabirov1,2 and Yasunobu
Okada2
(1Dept.
of Biophysics, National University of Uzbekistan, 2Dept. of Cell
Physiology, NIPS)
Maxi-anion channel, volume-sensitive outwardly
rectifying (VSOR) anion channel and cystic fibrosis transmembrane conductance
regulator (CFTR) channel have been suggested to mediate an electrogenic transport of ATP by different
groups. This function requires a pore wide enough for passing a bulky ATP
molecule. In the present study, we attempted to evaluate the physical
dimensions of the pores of the three putative ATP-channels.
(1) Single maxi-anion channels were recorded from
membrane patches excised from mouse mamMary C127 cells. We first analyzed the
permeability of the channel to a series of organic anions of different size. We
found a linear relationship between relative permeability of organic anions of
different size and their relative ionic mobility (measured as the ratio of
ionic conductance) with a slope close to 1, suggesting that organic anions
tested with radii up to 0.49 nm (lactobionate) move inside the channel by free
diffusion. In the second approach, we tested the pore of maxi-anion channel by
the nonelectrolyte exclusion method in single-channel patch-clamp experiments.
The cut-off radii of PEG molecules that could access the channel from
intracellular (‾1.16 nm) and extracellular (‾1.42 nm) sides indicated an
asymMetry of the two entrances to the channel pore. Measurements by symMetrical
two-sided application of PEG molecules yielded an average functional pore radius
of ‾1.3 nm.
(2) Single VSOR channels were recorded from the
cell-attached patches of human epithelial Intestine 407 cells pre-swollen in
hypotonic Hi-K+ solutions.
PEG 200-300 (Rh=0.27-0.53 nm) effectively suppressed the
single-channel currents, whereas PEG 400-4000 (Rh=0.62-1.91 nm) had
little or no effect. The cut-off radius of the VSOR channel pore was assessed
to be 0.63 nm.
(3) Single CFTR channels were recorded from
cell-attached and excised membrane patches from HEK293T cells transiently
transfected with CFTR gene using a bi-cistronic vector with GFP gene as a
reporter. The effect of polyethylene glycols on the single-channel CFTR
currents was different depending on whether they were added from extracellular
or intracellular side. The cut-off radius of PEG molecules that could access
the channel from the intracellular side (‾1.0 nm) was larger than that from the
extracellular side (‾0.6 nm) indicating an asymMetry of the two channel
entrances.
The radius of
ATP4-
and MgATP2-
(about 0.6-0.7 nm) is close to the limiting size of the VSOR channel pore and
narrowest part of CFTR channel. The size of maxi-anion channel (‾1.3 nm) is
largest among these three channels, therefore we suggest that it is best suited
to its function as an ATP channel and, where present, serves as the preferred pathway for the release of ATP4- and/or MgATP2-.
岩渕 徳郎1，中沢 陽介1，飯野 雅人1，江浜 律子1，尾郷 正志1，田島 正裕1，荒瀬 誠治2
（1資生堂リサーチセンター，2徳島大医）
核酸関連生体物質であるアデノシンがヒトの毛成長を促進することが明らかとなり，アデノシンが持つ幅広い生理作用があらためて認識されつつある。今回はアデノシンの毛成長促進機構について概説したい。
育毛薬剤として良く知られているミノキシジルは毛包でミキシジルサルフェートに変換され，アデノシン量を増加させることにより育毛効果を示すと考えられている(1)。また，アデノシン配合製剤を用いた6カ月間のヒト有効性試験でも育毛効果が確認され，特に太毛化効果が見られた(2)。
ヒト毛乳頭細胞に対するアデノシンの影響をマイクロアレイ解析したところ，毛成長促進因子であるFGF-7 (KGF; keratinocyte growth factor)発現を亢進することが明らかとなった。すなわち，アデノシンは毛乳頭細胞に直接作用し，FGF-7発現を亢進することにより毛成長を促進すると考えられた。免疫染色の結果，ヒト毛乳頭ではtype A2bのアデノシン受容体が発現していることが確認された。
アデノシンのアンタゴニスト併用実験より，ヒト毛乳頭細胞においてアデノシンは受容体A2bに作用し，細胞内cAMP濃度上昇を引き起こすことによりFGF-7の発現を亢進すると考えられた。FGF-7は毛幹を成す上皮系細胞の増殖・分化を促進し，ひいては毛成長を促進する因子である。また，男性型脱毛由来の毛乳頭細胞ではFGF-7発現の低下が観察され，アデノシンが当該細胞において低下したFGF-7発現を回復させることも明らかとなり，ヒト有効性試験で確認された効果の一端を説明できる結果が得られた。さらに，アデノシン類縁体であるグアノシンやイノシン等の影響についても言及したい。
(1)Li et al. (2001) J
Invest Dermatol 117:1594-1600
(2)Tajima
et al. (2004) Abstract of the 4th Intercontinental Meeting of Hair Research.
金田 誠，石井 俊行*，重松 康秀**，細谷 俊彦*，霜田 幸雄**
（慶應大・医・生理，理研・脳センター・細谷研究ユニット*，東京女子医大・総研**）
マウス網膜コリン作動性アマクリン細胞にはON型とOFF型の二種類が存在する。われわれは免疫組織化学的検討から，P2X2受容体がOFF型コリン作動性アマクリン細胞に選択的に発現していることを見出した。そこでGFPシグナルがコリン作動性アマクリン細胞のみに選択的に発現しているtransgenic mouseを用い，GFPシグナルをマーカーとしてコリン作動性アマクリン細胞にパッチクランプ法を適用し，ATPに対するコリン作動性アマクリン細胞応答について検討した。
ホールセルクランプ下にATPをコリン作動性アマクリン細胞に投与し，発生したATP応答をGABA応答で正規化して，OFF型コリン作動性アマクリン細胞とON型コリン作動性アマクリン細胞のATP応答の大きさを比較した。OFF型コリン作動性アマクリン細胞で観察されるATP応答はON型コリン作動性アマクリン細胞で観察されるATP応答より大きかった。またa，b-methyleneATPではATP応答が惹起されず，PPADS存在下でATPを投与したときにも応答は生じなかった。またATP応答は細胞外液への亜鉛添加で増強されたが，細胞外液のカルシウムを増加させると抑制された。ATPのコリン作動性アマクリン細胞への投与はシナプス前膜側からのGABA放出も同時に増強した。GABA放出の増強はON型とOFF型の両方で観察された。GABA放出の増強はa，b-methyleneATPでは惹起されなかったが，PPADS存在下でATPを投与しても観察された。またbenzoylbenzoylATPの投与でも惹起された。
以上の結果から，OFF型コリン作動性アマクリン細胞はシナプス後膜側のP2X2受容体による制御とシナプス前膜側のGABA作動性神経終末による二重の制御を受けるが，ON型コリン作動性アマクリン細胞はシナプス前膜側のGABA作動性神経終末による制御のみを受けると考えられた。薬理学的性質と免疫組織化学染色の結果から，シナプス前膜側に存在するプリン受容体はP2X4とP2X7の二つが可能性として考えられた。
以上の結果を元にマルチ電極法を用いて網膜神経節細胞の光応答を記録し，光刺激で生じる網膜神経節細胞の光応答がATPでどのように修飾されるか検討した。神経節細胞の光応答はATPを投与するとON型OFF型ともに抑制された。ON型とOFF型で見られる光応答の抑制様式の相違については現在検討中である。
山本 希美子，曽我部 隆彰，安藤 譲二
（東京大学 大学院 医学系研究科 医用生体工学講座 システム生理学）
【緒言】血管内面を覆う内皮細胞は血流と接することから，血流に起因する力学的刺激である剪断応力を受けている。内皮細胞は血流の変化を剪断応力の変化として認識し，その情報を細胞内部に伝えることで形態や機能や遺伝子発現を変化させる能力を有している。血流に対する内皮細胞の反応は生体で起こる血流依存性の現象である血管新生やリモデリング，あるいは動脈瘤や粥状動脈硬化などの血管病の発生に深く関わっている。しかしながら，内皮細胞が血流をどの様にセンシングしているのか，その分子機構は未だ明らかになっていない。そこで，我々は細胞内情報伝達系の主要なセカンドメッセンジャーとして働くCa2+の動態の面から，内皮細胞の血流センシング機構を検討した。
【実験方法】ヒト肺動脈内皮細胞(HPAEC)にCa2+感受性色素Indo-1を取り込ませ，平行平板型の流れ負荷装置により剪断応力(1-20 dynes/cm2)を負荷した時の細胞内Ca2+濃度変化を共焦点レーザ顕微鏡で測定した。内皮細胞におけるATP作動性カチオンチャネルP2Xのサブタイプの遺伝子発現レベルを競合PCR法で比較した。HEK293細胞にP2X4のcDNAを強発現させた細胞株を樹立した。また，P2X4 KO マウスを作製し，肺の微小血管から培養した内皮細胞の剪断応力に対するCa2+反応を解析した。また，内皮細胞にNO指示薬であるDAF2を取り込ませ，剪断応力によるNO産生の変化を評価した。さらに生体顕微鏡下にマウスの骨格筋の細動脈を観察し，血流増加に対する血管拡張反応を解析した。
【結果】HPAECにハンクス平衡塩類溶液の灌流による流れ刺激を与えると，剪断応力の強さに依存した細胞内Ca2+濃度の上昇反応が現れた。流れを止めるとCa2+濃度は初めのレベルに復帰した。EGTAで細胞外Ca2+をキレートすると流れによる反応が完全に消失したことから，Ca2+の動員経路は細胞外からの流入と考えられた。また，ATPを分解するapyraseを灌流液に加えると，流れによるCa2+流入反応が完全に抑制された。このことから，ATP作動性カチオンチャネルであるP2X の関与が示唆された。HPAECのP2X発現を競合PCRで解析したところサブタイプのP2X4が優勢的に発現していることが示された。P2X4のアンチセンスオリゴを細胞に導入しP2X4の発現を約20%にまで低下させると流れ刺激によるCa2+流入反応がほとんど消失した。また，P2X4の遺伝子欠損マウスの肺微小血管内皮細胞においても流れ誘発性Ca2+流入反応は起こらなかった。流れ刺激に対してCa2+反応を示さないHEK293にP2X4の遺伝子を発現する細胞株を樹立し，流れ刺激によるCa2+反応を測定したところ，コントロールの細胞ではCa2+応答は確認されなかったが，P2X4を発現している細胞では剪断応力依存性のCa2+濃度上昇反応が確認された。内皮細胞の流れ刺激によるNO産生反応をP2X4 KOマウスと野生型(WT)マウスで比較した。WTの肺の微小血管内皮細胞では剪断応力に依存したNO産生が見られたが，KOマウスではNO産生が起こらなかった。骨格筋の微小血管観察により，WTマウスで見られた血流増加に対する細動脈の拡張反応がKOマウスで著明に抑制されていた。血圧もKOマウスではWTマウスに比較して有意に上昇していた。
【考察】今回の検討により，内皮細胞において剪断応力の強さの情報が細胞外Ca2+の流入量に変換されることが示された。その機構として細胞膜に発現するイオンチャネルであるP2X4が重要な役割を果たしていることが明らかになった。本来，流れ刺激に反応しないHEK細胞に遺伝子導入でP2X4を発現させると流れ刺激に対してCa2+反応を示すようになったことからP2X4が血流センサー分子として働く可能性が示された。実際，生体でP2X4を介する血流センシングがどの様な生理的意義を有しているのかについて，P2X4のKOマウスで検討した。その結果，P2X4は血流刺激による血管のNO産生に関わっていること，血流増加に対する細動脈の拡張反応や血管のトーヌスの調節にも重要な役割を果たしていることが示された。
尾松 万里子，松浦 博（滋賀医科大学・生理学講座・細胞機能生理学部門）
マウス胎児由来前駆脂肪細胞3T3-L1細胞は，成熟脂肪細胞に分化するためには細胞周期がG0/G1で停止することが必要である。通常の培養実験では細胞をコンフルエントになるまで培養し，接触障害により細胞周期を停止した後，adipogenic hormonesであるdexamethasone，1-methyl-3-isoxanthine及びinsulinを分化誘導因子として加えることによって成熟脂肪細胞に分化させる方法が最も標準的な手法として用いられている。また，細胞密度の低い増殖中の細胞にadipogenic hormonesを加えても分化は起こらないことが古くから知られている。我々は，50%以下の低い細胞密度の前駆脂肪細胞にATPを与えてインキュベーションした後にadipogenic hormonesを加えると，増殖を続けながら成熟脂肪細胞に分化することを見いだした。これらの効果はP2受容体阻害剤スラミン及びphospholipase C阻害剤であるU-73122によって阻害されたことからP2Y受容体を介すると考えられた。ATPで前処理した後にadipogenic hormonesを加えた細胞とコンフルエントに達してからadipogenic hormonesを加えた細胞を比較すると，細胞の増殖や分化後の中性脂肪の量には差がなかった。しかし，成熟脂肪細胞のマーカー蛋白であるadipose protein 2のmRNAの発現量を調べてみると，ATPで前処理した細胞の方が通常の方法で処理した細胞よりも3日早く増大し，ピークに達していることがわかった。これらのことから，未分化細胞においてP2Y受容体刺激はadipogenic hormonesに対する感受性を増大させ，増殖中にも関わらず脂肪細胞への分化が起こると考えられた。
山崎 大樹1，大矢 進1，村木 克彦2，浅井 清文3，今泉 祐治1
（1名古屋市大院・薬・細胞分子薬効解析，
2愛知学院大・薬・細胞薬効，3名古屋市大院・医・分子神経生物）
血液脳関門は脳内に広く分布し，一層の脳血管内皮細胞から成る。周囲はタイトジャンクションの形成に重要な役割を担うアストロサイトに覆われている。現在までに末梢血管内皮細胞においては各種イオンチャネルの発現分布とその機能解析が進展している。一方で，脳血管内皮細胞におけるイオンチャネル及び受容体に関しては不明な点が多い。ATPはアストロサイトや神経より遊離または漏出し脳血管内皮細胞に作用すると考えられるが，その作用機構の詳細は明らかでない。本研究では，ウシ脳血管内皮不死化細胞(t-BBEC 117)を用いて，細胞外ATPによる脳血管内皮細胞におけるプリン作動性受容体及びイオンチャネル活性制御機構とその生理的意義を明らかにすることを目的とした。
まず，RT-PCR によりt-BBEC 117においてmRNAが高発現しているプリン作動性受容体サブタイプを解析した。また細胞内Ca2+濃度([Ca2+]i)測定において，小胞体のCa2+-ATPase阻害薬であるタプシガルギン適用後には，ATPによる[Ca2+]i上昇は生じないことを見出した。これらの結果および薬理学的解析から，ATPによる[Ca2+]i上昇には主にP2Y1，P2Y2受容体を介したCa2+遊離が関与していると示唆された。一方，イオンチャネルとしてはCa2+活性化K+チャネルであるSK2，TRPC1/3，内向き整流性K+チャネルであるKir2.xなどが機能的に発現していることが明らかとなった。
次に，これら受容体およびイオンチャネルの機能連関を検討した。ATPによる[Ca2+]i上昇はSK2チャネルを活性化させ，細胞を過分極させることによりTRPC1/3を介したCa2+流入を増幅させることを見出した。すなわち[Ca2+]i制御における正帰還機構の存在が示唆された。ATP刺激による[Ca2+]i制御の正帰還機構が細胞増殖に関与している可能性を検討した。MTT法を用いて増殖に対する影響を検討したところ，100 mM ATPgSは48時間後において増殖を有意に促進させ，SKチャネル阻害薬であるUCL1684及びTRPC1/3阻害薬であるLa3+はそれぞれATPgSによる増殖促進を抑制した。以上より脳血管内皮細胞において細胞外ATPは[Ca2+]i制御の正帰還機構を介して細胞増殖に寄与していることが示唆された。
さらに約20%のt-BBEC 117細胞において，ATPによりK+の平衡電位付近までの過分極が生じることを見出した。これらの細胞ではBa2+による反応からKir2.xチャネルの発現量が高くなっていると推測され，ATPによるSK2チャネルの活性化がKir2.xチャネルの活性化の起因となって，更なる過分極を起こすスイッチング機構の存在することが示唆された。このスイッチング機構作動は過大なCa2+流入を生じさせ，細胞死の方向へ導くと考えられる。すなわち，Kir2.x発現量が細胞死を制御している可能性が推測された。
以上よりATPは脳血管内皮細胞において[Ca2+]i調節にかかわるSK2およびKir2.xチャネルという2つのK+チャネルおよびTRPC1/3チャネルの活性制御を介して，細胞増殖と細胞死という正反対の作用を示す可能性が示された。
戸崎 秀俊1,2，津田 誠1，小泉 修一2，井上 和秀1
（1九州大学 大学院 薬学府，2国立衛研薬理部）
細胞外ATPは中枢において，ATP受容体を介した情報伝達を担う重要なシグナル分子である。P2X4受容体はイオンチャネル型のATP受容体の一つで，本研究室は神経傷害時の疼痛モデルラットの脊髄内でミクログリアが活性化し，その細胞膜表面でのP2X4受容体の発現増強が見られ，この受容体が直接疼痛に関わっていることを見出した。しかしミクログリアのP2X4受容体の急激な発現調節については未だほとんどわかっていないのが現状である。そこでラットP2X4遺伝子の上流領域約2 kbpをクローニングし転写因子結合サイトを検索したところ，核内受容体の認識配列に相同性のある配列がみつかった。
レチノイン酸はビタミンAの誘導体であり，retinoic acid receptor (RAR)，retinoid X
receptor (RXR)といった核内受容体に結合し，応答配列をもった遺伝子の転写活性を制御することができる。特にRXRは様々な核内受容体とヘテロダイマーを形成し標的遺伝子の転写活性を制御する重要な核内受容体である。クローニングしたP2X4遺伝子上流領域のプロモータ活性をdual luciferase assayを行い定量したところ，この配列内にレチノイン酸に応答するサイトの存在が示唆された。Quantitative RT-PCR法を用いた解析からRXR，RARのアゴニストである9-cis retinoic acid (9-cisRA)，RARのアゴニストであるall-trans retinoic acid (atRA)処置により初代培養ミクログリアに発現しているP2X4受容体mRNAは，濃度，時間依存的に有意なmRNA量の増加を示すことが観察された。同様の増大作用はRAR及びRXRの合成アゴニスト処置によっても認められた。Western blotting法を用いた解析により9-cisRA処置によって有意なP2X4受容体タンパク量の増大が観察され，また細胞内Ca2+ 応答を指標とした検討によりミクログリアP2X4受容体の機能亢進も観察された。以上より，P2X4遺伝子上流領域にレチノイン酸応答配列が存在していること，RARおよびRXRアゴニスト処置によりP2X4受容体のmRNA，タンパクの発現量が増大すること，P2X4を介したミクログリアの機能が亢進することが確かめられた。脊髄や後根神経節では，神経傷害時における組織内でのレチノイン酸合成酵素の発現量が急激に増大している。つまり，脊髄ミクログリアP2X4の発現増大から引き起こされる神経因性疼痛にはレチノイン酸による転写調節が重要な発現経路の一つであることが示唆される。
長谷川 茂雄，津田 誠，井上 和秀（九州大学 大学院 薬学府 薬効解析学分野）
ATPは末梢の一次求心性神経に存在するP2X3，P2X2/3，P2Y1およびP2Y2受容体を介して，痛みの発生およびその調節機構に重要な役割を有している。しかし，その詳細なメカニズムについては依然未解決な部分が多い。一方で，プロスタグランジン類等の脂質メディエーターも，ATPと同様に痛覚過敏やアロディニアを誘発することから，ATP受容体刺激後のシグナルとして何らかの関連性が予想される。プロスタグランジンやロイコトリエンなどの脂質メディエーターは，細胞質型ホスホリパーゼA2 (cytosolic phospholipase A2; cPLA2)により膜脂質から切り出されたアラキドン酸によって生合成されることから，cPLA2の活性状態は痛覚伝達系の制御に重要な役割を演じている可能性がある。cPLA2の活性化には，C2ドメインへのCa2+の結合及びセリン残基のリン酸化が必要であることが知られている。そこで本研究では，一次求心性神経（後根神経節細胞 dorsal root ganglion; DRG）におけるcPLA2の活性化に対するATPの効果について検討した。
cPLA2の活性化は，活性化型であるSer505リン酸化型cPLA2(Phosphorylated cPLA2; p-cPLA2)タンパク質を，その特異的抗体を用いたウエスタンブロッティング法により検出し，その発現レベルから評価した。ラット初代培養DRGニューロンをATPで処置すると，p-cPLA2発現レベルはATP 1mMから10mM の範囲で濃度依存性に増加し，また，ATP 10mM処置後5分でピークに達した。このATPによるp-cPLA2の発現増加は選択的P2X3及びP2X2/3受容体アンタゴニストであるA-317491の前処置により抑制された。また，P2X1, 3, 2/3受容体アゴニストであるa，b-methylene ATPによりp-cPLA2レベルが増加した。一方，P2Y1およびP2Y2受容体アゴニストである2MeSADPおよびUTPの処置によっても，p-cPLA2タンパク質の発現増加が見られた。現在知られている4つのcPLA2サブタイプ(a，b，g，d)の中で，cPLA2aはアラキドン酸を含むリン脂質に選択性を示す。そこで，培養DRGニューロンにcPLA2ainhibitorを前処置した結果，ATPによるp-cPLA2タンパク質の発現増加は阻害剤で抑制された。
以上の結果は，一次求心性感覚神経において，ATPがP2X3，P2X2/3，P2Y1およびP2Y2受容体を介してcPLA2，特にcPLA2aを活性化することを示唆しており，このcPLA2aの活性化がATPによる痛みの発生・調節機構に何らかの役割を有している可能性が考えられる。
月本 光俊，原田 均，五十里 彰，高木 邦明，出川 雅邦（静岡県立大・薬）
【目的】P2X7受容体はATPとの結合により活性化すると陽イオンの流入・分子量約900 Da程度までの分子を通す小孔の形成・サイトカインの放出・細胞死の誘導などを引き起こすことが報告されている。最近，我々はこれらに加えて細胞外液中のCl-に依存した細胞径の縮小（細胞縮小：アポトーシス初期の特徴）が誘導されることを見出している。今回はマウスリンパ球におけるP2X7受容体活性化による細胞縮小について報告する。
【方法】4-6週齡Balb/c系マウスの胸腺および脾臓から分離した細胞を用いて実験を行った。P2X7受容体蛋白質の発現は特異的抗体を用いたウエスタンブロット解析により，細胞障害性は細胞外に漏出した乳酸脱水素酵素の活性を測定することにより調べた。細胞径の変化はフローサイトメーターを用いて前方散乱光および側方散乱光を測定することにより解析した。また，膜抗原の染色には蛍光標識抗マウスCD4, CD8およびB220モノクローナル抗体を用いた。
【結果および考察】P2X7受容体蛋白質の発現量は胸腺細胞に比べて脾臓細胞に多く，ATP処置による細胞死の誘導は胸腺細胞に比べて脾臓細胞においてより早く検出された。細胞径の変化について解析した結果，脾臓細胞においてはATP処置後数分で速やかに縮小細胞の割合が増加した。一方，胸腺細胞では処置後90分まで緩やかに縮小細胞の割合が増加した。両細胞群ともP2X7受容体アゴニストである2'-&3-O-(4-benzoyl-benzoyl)-ATP処置でも細胞縮小の誘導が認められ，P2X7受容体アンタゴニストであるoxidized ATP前処置により阻害されたことから，P2X7受容体を介して細胞縮小が誘導されていると考えられた。
次いでT細胞の分化状態との関係について検討した結果，胸腺細胞中約8割を占める未分化なCD4+8+胸腺細胞はATPにほとんど反応せず，CD4-8+胸腺細胞 < CD4+8-胸腺細胞 < CD8+脾臓細胞 < CD4+脾臓細胞の順に強い細胞縮小の誘導が認められた。このことは分化・成熟したT細胞において細胞縮小活性が強いことを示している。一方，脾臓中のB細胞は細胞縮小が誘導されなかった。これまでP2X7受容体誘導性細胞死は，胸腺におけるT細胞分化過程に関与しているとされてきた。しかしながら，本研究により分化・成熟したT細胞の方が高感度に細胞死が誘導されることが明らかとなり，胸腺中での分化過程のみならず末梢でのT細胞機能においてもP2X7受容体が重要な役割を担っているものと考えられる。
趙 玉梅，佐藤 千江美，右田 啓介，桂木 猛（福岡大・医・薬理）
ATPはオートクリン/パラクリン分子としてP2XおよびP2Y受容体を介して，広汎で多彩な細胞機能調節作用を示すことは良く知られているが，その細胞外への放出機構，また，どのような細胞内部位から放出されるかについてはほとんど不明のままである。本研究は，これらの点を明らかにする目的で，モルモット結腸紐の培養平滑筋細胞を用いてbradykininによるATP放出実験を行った。
その結果，bradykininはB2-受容体刺激により，濃度依存性にATPを放出した。このATP放出はphospholipase C - Ins(1,4,5)P3シグナル系の一連の阻害薬（U-73122やthapsigarginなど）やNEM，staurosporinにより著しく抑制された。さらにこれはMK-571，benzbromaroneなどのMRP阻害薬で拮抗されたが，CFTR-Cl- channelブロッカー（glybenclamide，Gd3+など）やhemi
channelブロッカー（gap23など）ではほとんど影響されなかった。このATP放出はミトコンドリアの機能を阻害するoligomycinやCGP37157などで，またゴルジ体からの小胞輸送を阻害するbrefeldin Aによっても抑制されなかった。ウェスタンブロッティングによる実験で，同細胞には，MRP2やMRP3ではなくMRP1の蛋白質の発現が認められた。
これらのことより，bradykininはB2-受容体刺激によりIns(1,4,5)P3シグナルを介して，恐らくERからのATP遊離を引き起こし，このATPが膜の多剤耐性蛋白質(MRP1)のnucleotide binding domainに結合し，これを活性化してATP自身が細胞外へ放出されるものと考えられる。
有村 由貴子1，佐藤 あゆみ1，西川 香里2，青木 公三子2，和田 恵津子2，
青木 俊介2，和田 圭司2，野田 百美1（1九州大・院・薬・病態生理，
2国立精神・神経センター・神経研・疾病研究第4部）
parkin遺伝子は，若年性常染色体劣性遺伝型の家族性パーキンソン病(AR-JP)の原因遺伝子として1998年に発見された。その遺伝子産物であるParkinは，ユビキチンリガーゼの一種であると考えられ大脳黒質に豊富に存在することが知られている。さまざまな神経変性疾患では，ユビキチン・プロテアソーム系の破綻が提唱されており，実際AR-JP患者のparkin遺伝子が変異して，Parkinの活性が喪失していることが分かっている。また，Parkin の基質タンパクであるalpha-synucleinの凝集体がパーキンソン病患者から多数見つかっていることから，Parkinの機能異常によるalpha-synucleinの蓄積がパーキンソン病に関与していることが示唆されている。その一方で，神経回路機能におけるParkinやalpha-synucleinの役割についてはいまだに解明されていない。
本研究では，神経系に広く分布し，様々な神経伝達物質の放出に関与しているATP受容体に着目し，Parkinやalpha-synucleinがその活性にどのように関与しているのかを電気生理学的に検討した。
その結果，Parkinは，PKAの活性化を介してATP誘発電流を増大させることが明らかになった。また，このPKA活性の制御にDARPP-32
(dopamin and cAMP-regulated phosphoprotein with molecular weight of about
32000)が関与する可能性も示唆された。しかし一方で，ユビキチン水解酵素やParkinと同様にlysine
63を介してユビキチン鎖を形成することが報告されているalpha-synucleinはATP誘発電流に顕著な影響を及ぼさなかった。これらの結果より，ParkinはATP受容体に対してPKA，DARPP-32を介して調節的な役割を果たしていることが考えられ，今後，ParkinがP2X受容体を介して神経伝達物質の放出に関与しているかについても明らかにしたい。
道川 誠（国立長寿医療センター研究所 アルツハイマー病研究部）
【目的】ApoE，ABCA1，CYP46等のコレステロール代謝関連遺伝子多型とアルツハイマー病発症との相関が指摘されている。しかし，如何なる分子機構によってコレステロール代謝変動が神経細胞変性を誘導するかについてはよく解っていない。この分子機構の解明を目的に，コレステロール代謝障害に起因する神経変性疾患（アルツハイマー病と極めて類似するタウオパチーを来たす）であるNiemann-Pick C1 (NPC1)病マウスをモデルに選び，その脳および神経細胞を生化学的に解析した。
【方法】NPC1マウス脳およびそれらから準備した培養神経系細胞（神経細胞とグリア細胞）に対して，電子顕微鏡による観察およびミトコンドリア機能評価（JC-1染色によるミトコンドリア膜電位の評価），ATP定量，ATP合成酵素活性を定量した。更にミトコンドリアを精製し，ミトコンドリア膜における脂質解析，ミトコンドリア膜コレステロールの増減によるATP合成酵素活性への影響を検討した。
【結果】(1)NPC1型マウス脳のミトコンドリアは小さく内部構造に乱れが見られた。
(2) NPC1型の神経細胞/アストロサイトにおけるミトコンドリア膜電位は低下していた。
(3) NPC1型マウス脳のATP量は，野生型に比し約60-70%程度に低下していた。
(4) NPC1型マウス脳のATP合成酵素活性は，野生型に比し約60%程度に低下していた。
(5)NPC1型ミトコンドリア膜コレステロール濃度は野生型に比し有意に高値であり，コレステロール濃度を薬剤により低下させるとATP合成酵素活性は野生型と同程度まで回復した。
(6)野生型ミトコンドリア膜コレステロール濃度は上昇しても低下してもATP合成酵素活性は低下した（ミトコンドリア膜コレステロール濃度には至適濃度がある）。
【考察】(1)コレステロール代謝変動がミトコンドリア膜のコレステロール濃度変化を介して神経細胞変性を郵送する可能性が示された。(2)アルツハイマー病では，Abに起因する神経細胞内コレステロール代謝変動がタウ蛋白のリン酸化亢進を伴う神経細胞変性（タウオパチー）を誘導するが，NPC1病では，NPC1欠損に起因する神経細胞内コレステロール代謝変動がタウオパチーを誘導すると考えられる。興味深いことにアルツハイマー病脳でもミトコンドリア機能障害がみられることから，この両疾患では神経変性過程の一部を共有すると考えられる。(3)両疾患ともapoE4型では病理進展が増強することから，apoE-HDLによるコレステロール輸送・供給機構がこの神経変性過程に関与（修復・恒常性維持等）していると推測される。
Fernando Lopez-Redondo1, Kimiko
Yamamoto2, Joji Ando2, Kishio Furuya1,
Kumi Akita1, Keiji Naruse1,3,
Masahiro Sokabe1,3,4
( 1Cell Mechanosensing, SORST, JST;
2Dept Biomed Engin, Grad Sch Med, Univ Tokyo;
3Dept Cell Biophysics, Grad
Sch Med, Nagoya Univ; 4Dept Mol Physiol, Natl Inst Physiol Sci)
Endothelial cells (ECs) sense
hemodynamic forces (pressure and shear stress) from the flowing blood. P2X4
is constitutively expressed at a high level in ECs. Yamamoto et al found a
shear stress-dependent Ca2+ influx mediated by the P2X4
purinergic receptor as confirmed by sense and anti-sense oligonucleotide
techniques. Human embryonic kidney (HEK293) cells that have no Ca2+
response to flow, were able to show a cytosolic Ca2+ increase when
they transfected with P2X4. In order to determine if P2X4
can sense the shear force, we investigated whether direct mechanical
stimulation of P2X4-containing outside-out patches were activated by flow.
Patch-clamp recordings from HEK293 cells stably expressing P2X4
showed single channel activity following the flow stimulation with Hank’s
solution. The permeation property of the styryl dye FM1-43 through
mechano-transduction channels was also assessed in our case. Epifluorescence
and confocal microscopy showed FM1-43 (5 mM) uptake in P2X4-transfected HEK293
cells after ATP (10 mM)
or flow stimulations. These findings indicate functional activities of P2X4
and suggest that P2X4 could likely be a primary shear-stress sensor in endothelial cells.
藤森 廣幸，宮本 晃洋，堀内 隆宏，芳生 秀光（摂南大・薬・衛生分析化学）
組織内のアデニン類のうち ATP，ADP，5’-AMPおよびcAMP等は高エネルギー担体やエネルギー代謝中間物質であり，種々の酵素活性調節因子あるいは細胞内外の情報伝達物質としての作用を有する物質である。また，アデニン類はRNAやDNAなどの核酸の構成成分であり，遺伝情報の保存あるいは伝達に寄与していることは周知の事実である。RNA中のアデニン残基はRNA分解酵素により最終的には，5’-AMPあるいはadenosine (Ado) の3’位の水酸基にリン酸が結合した3’-AMPに分解代謝される。3’-AMPは薬理学的にはアデニル酸シクラーゼの内因性阻害物質として分類されているが，3’-AMPおよび3’-AMP産生酵素の生体内意義は未だ不明である。
出生直後のマウス脳は増殖性を有しており，漸次分化し記憶・学習等の高次機能を有する脳を形成していく。増殖性の細胞はRNA代謝能が亢進するので，脳内の3’-AMP含量および3’-AMP産生酵素活性が変動する可能性がある。また，脳の構成細胞の増殖・分化に伴って脳内のアデニン類の含量も変動することが推察される。
非常に素人的発想に基づき本研究では，マウス脳内のアデニン類含量および3-AMP産生酵素活性系に及ぼす出生前後からの加齢の影響を検討した。
ICR系マウス脳からアデニン類を含む酸可溶性物質を過塩素酸で抽出した。3’-AMP産生酵素活性は基質poly(A)を用いて測定した。アデニン類は標識試薬のchloroacetaldehyde で蛍光化した後，HPLC法により分離・定量した。
胎児全脳および出生1，3日齢の総アデニン量(ATP+ADP+AMP)およびATP含量は約0.5および0.2 nmol/mg湿重量で，ほぼ同程度であった。1から8週齢の脳のATP含量はみかけ急激に減少した。これは，エーテル麻酔下で脳を摘出してアデニン類を抽出するまでに，脳内のATPが急速に5’-AMPへと分解されることが推察された。胎児全脳の3’-AMP含量は低値であったが，生後1週間後に最大となり3週齢まで持続した。一方，胎児全脳中の3’-AMP産生酵素活性は高く，その活性は生後1週齢まで徐々に減少したが 2週齢で最大となった。1週齢マウスの大脳，小脳および脳幹の3’-AMP産生酵素活性は同程度であった。しかし，2週齢になると大脳の産生酵素活性は約10倍にも上昇したが，小脳および脳幹の活性は変動しなかった。以上の結果より，胎児期では総アデニン量および3’-AMP産生酵素系は各々ほぼ一定値を示したが，出生後1-2週齢を境に脳内のATP分解系および3’-AMP産生酵素系が変動し，特に，大脳の3’-AMP産生酵素活性は急激に上昇し，大脳の何らかの機能を調節している可能性が示唆された。
乙黒 兼一，山地 良彦，伴 昌明，太田 利男，伊藤 茂男
（北海道大学 大学院獣医学研究科 薬理学教室）
アシドーシスは中枢神経系に重篤な機能不全を引き起こすことが知られており，低酸素とともに虚血性疾患における重要な病態のひとつである。近年，アシドーシスによってアデノシンが放出され冠血流量を増加させることが摘出心標本を用いた実験で報告されたが，中枢神経系におけるアシドーシスの影響とそれに対するアデノシンの関与については明らかにされていない。そこで本研究では新生ラット（0-3日齢）から摘出した脊髄半裁標本を用いて，電気刺激によって生じる脊髄反射電位に対する高炭酸惹起アシドーシスの作用と，その作用におけるアデノシンの関与について検討した。摘出脊髄標本を人工脳脊髄液(ACSF，5% CO2，pH 7.3)で灌流し，脊髄後根(L3-L5)を電気刺激し対応する前根からmonosynaptic reflex potential (MSR)とslow ventral root potential (sVRP)を記録した。高炭酸低pH ACSF(20% CO2，pH 6.7)は，MSRとsVRPを可逆的に抑制した。A1受容体拮抗薬CPTはこの抑制反応を部分的に回復させたが，A2A受容体拮抗薬ZM241385は影響を与えなかった。低pH ACSF(5% CO2，pH 6.7)又は高炭酸ACSF(20% CO2，pH 7.3)によってもMSRとsVRPは抑制されたが，CPTは低pH ACSFによる抑制反応のみを部分的に回復させ，高炭酸 ACSFによる抑制には影響を与えなかった。高炭酸低pH ACSFによる抑制効果は5’-エクトヌクレオチダーゼ阻害剤AOPCPの影響を受けなかった。アデノシンキナーゼ阻害剤NH2dADは高炭酸低pH ACSFと同様にMSRとsVRPを抑制し，この抑制効果はCPTで回復した。一方アデノシンデアミナーゼ阻害剤EHNAはMSRには影響を与えずsVRPのみを抑制し，この抑制効果はCPTで回復しなかった。高炭酸低pH ACSFは細胞外アデノシン量を増加させた。以上の結果から高炭酸惹起アシドーシスによるpHの低下がアデノシン放出を引き起こし，A1受容体を介して脊髄反射電位を抑制していると考えられる。アデノシン放出にはアデノシンキナーゼ活性の抑制が関与していることが示唆された。
篠崎 陽一1，小泉 修一1，井上 和秀2（1国立衛研・薬，2九州大・薬・薬効解析）
ATPは中枢神経系(CNS)においてATP受容体（P2受容体）を介してグリア間(gliotransmission)及びグリア-神経間(glia-neuron transmission)の情報伝達を行う最も重要な分子の一つである。私は前年の研究会においてATPがP2Y1受容体を介してアストロサイトのH2O2誘導性細胞死に対して保護作用を発揮する事を報告した。本研究ではアストロサイトにおけるH2O2誘導性細胞死を引き起こす細胞内シグナリングの同定とそれに対するATP/P2Y1受容体の作用メカニズムの解明を目的とした。過去の報告からアストロサイトではH2O2刺激によりmitogen-activated protein kinases(MAPK)が活性化する事が知られている。薬理学的解析，ウェスタンブロッティング及び免疫組織化学による解析からextracellular signal-regulated kinase
1 and 2(ERK1/2)の強い活性化とリン酸化ERK1/2(P-ERK1/2)の持続的な核への集積がH2O2誘導性細胞死に関わると考えられた。MEK1/2阻害剤及びATPはH2O2誘導性ERK1/2活性化，P-ERK1/2の核集積，細胞死を抑制した。GeneChipによる解析の結果，ATPはERK1/2などMAPKの不活性化に関わるMAPK phosphataseの発現増加は誘導しなかったものの，protein tyrosine phosphatase(PTP)の発現増加が誘導されており，さらに酵素活性の増加も確認された。ATPによる保護作用およびERK1/2活性化抑制作用はPTP阻害剤Na3VO4によって消失した事から，ATPによるPTPの発現及び活性増強がその保護作用に関わると考えられた。一方，H2O2によって種々のprotein tyrosine kinase(PTK)が活性化する事から，PTKのH2O2誘導性細胞死への関与を調べた。H2O2はタンパクチロシンリン酸化を引き起こし，ATPはH2O2によるチロシンリン酸化を抑制した。更に，H2O2誘導性細胞死がsrc family選択的阻害剤PP1によって濃度依存的(10〜250 nM)に抑制される事，PP1がH2O2誘導性タンパクチロシンリン酸化を抑制する事からH2O2によってPTK，特にsrc familyが活性化する事によって細胞死が引き起こされる事が明らかとなった。PP1処置によってH2O2誘導性ERK1/2活性化が抑制された事から，アストロサイトにおけるH2O2誘導性細胞死はsrc familyとそれに続くERK1/2活性化によって引き起こされる事が明らかとなった。ATPはH2O2によって活性化される細胞内シグナルを抑制する事によって細胞死からアストロサイトを保護すると考えられた。
柳 涛，藤田 亜美，中塚 映政，熊本 栄一
（佐賀大学医学部生体構造機能学講座神経生理学分野）
皮膚末梢から脊髄後角に至る痛み情報は，後角第II層（膠様質）においてアデノシンを含む様々な内因性鎮痛物質の働きにより制御を受けることはよく知られている。昨年の生理学研究所研究会において，アデノシンが膠様質のA1型アデノシン受容体を活性化することにより (1) 膜を過分極すること，(2) 神経終末から起こるグルタミン酸放出を抑制することが，アデノシンの鎮痛作用に寄与することを報告した。脊髄後角シナプスにおけるアデノシンは，ニューロンやグリア細胞から放出されたアデノシンやATPに由来すると考えられている。今回，(1)アデノシンを細胞内外に輸送するequilibrative nucleoside-transport (ENT)，(2)アデノシンをイノシンとアンモニアに分解する adenosine deaminase (ADA)，そして(3)アデノシンを 5’-AMP にリン酸化するadenosine kinase (AK) の働きに注目し，それらの阻害剤がアデノシンによる膠様質興奮性シナプス伝達修飾作用にどんな作用を及ぼすかを調べた。
実験は，成熟ラットから作製した脊髄横断スライス標本の膠様質ニューロンに通常のブラインド・ホールセル・パッチクランプ法を適用して行った。保持電位-70 mVでアデノシン(200 mM)の2分間灌流投与により誘起される外向き膜電流は，ENT阻害剤
(S-(4-nitrobenzyl)-6-thioinosine, NBTI; 1 mM)やADA阻害剤(erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)
adenine, EHNA; 1 mM)により，その持続時間を延長された。一方，AK 阻害剤(iodotubercidine, IOT; 1 mM)はその膜電流の下降相を緩徐にした。アデノシン(10 mM)による自発性興奮性シナプス後電流の発生頻度の抑制は，その程度や経時変化についてNBTI(1 mM)，EHNA(1 mM)，そしてIOT(1 mM)により顕著な影響を及ぼされなかった。以上より，アデノシンの輸送体や代謝の働きの変化はそのシナプス後性作用に効果を及ぼすことが明らかになった。アデノシンのシナプス前性作用については，今後，更に検討する必要がある。
藤居 祐介，尾松 万里子，松浦 博（滋賀医科大学・生理学講座・細胞機能生理学部門）
ホスホリパーゼC(PLC)連関型P2Y受容体は，リガンドが結合すると細胞膜リン脂質の一員であるホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸(PIP2)を分解し，ホスファチジルイノシトール-三リン酸(IP3)及びジアシルグリセロール(DAG)を生成すると考えられている。PIP2の動態はPIP2に対して高い親和性を持つプレクストリンホモロジー(PH)ドメインと融合させた蛍光タンパクGFPを培養細胞に発現させることによって観察されてきたが，単離細胞において観察することは困難であった。今回，我々は抗PIP2抗体を用いて受容体刺激による細胞膜PIP2の減少を経時的に測定する方法を確立した。褐色脂肪細胞をATPで刺激して細胞膜PIP2の変化を測定したところ，細胞膜における減少のピークはATPでは刺激後10秒であり，その後は徐々に再合成され，2分後には刺激前と同レベルまで回復することがわかった。ホスファチジルイノシトール-4-キナーゼ阻害剤であるウオルトマンニン存在下では，ATPによって細胞膜PIP2は分解されたが再合成は見られなかった。また，別のGq/PLC連関型受容体であるα受容体をノルアドレナリンで刺激しても同様の結果が得られた。これらのことから，P2Y受容体刺激による細胞膜PIP2の一過性の減少について検討した。
岩永 ひろみ（北海道大学 大学院 医学研究科 組織・細胞学分野）
毛の動き受容器，槍型神経終末のグリア細胞は，分岐する突起でつながり合い，異なる軸索終末間を連絡する網をつくる。一般に，受容体を介する細胞内Ca2+ 濃度の一過性上昇は，細胞網工や上皮シートに沿って波として伝わり，協調的な細胞活動を惹き起こすことが知られる。この細胞境界を越えたCa波の伝播機構に関し，今までに対立する2説が提出された。ひとつは，ATPなどの生理活性物質の細胞外拡散に基づく考え，もうひとつは，細胞内信号物質のギャップ結合を介した移動を重視する考えである。2つの信号伝播因子の関与を検討する目的で，ラット洞毛周囲槍型終末を膜片標本として分離し，微小ガラス針でグリア網局所に接触刺激を与えときにみられるCa信号の生成・伝播過程を，共焦点顕微鏡で解析した。
ガラス針で一つの槍型終末に軽く触れると，直後に，その終末を包むグリア突起のCa2+ 濃度が単峰性に上昇し，15-150秒で回復した。比較的持続時間の長いCa応答のあとには，刺激点付近の2-5本の槍型終末で，伴行するグリア突起のCa2+ 濃度が，遅れて上昇するのが観察された。この2次的Ca信号には，各グリア突起の決まった場所から独自に生成するものと，突起の近位部から外来性に入ってくるものとが区別され，前者は，刺激後1-5秒の潜時をもって刺激点から25mm以内の槍型終末に次々と波及し，応答グリア細胞は，必ずしも機械刺激を受けたグリア細胞と突起のつながりをもたなかった。一方，後者の信号は，刺激点からの距離に関わりなく，機械刺激されたグリア細胞の突起に観察され，その突起と直接結合する他の細胞の突起に伝播することもあった。このグリア応答の潜時は，刺激局所から細胞体を経てその突起に至るまでの細胞質の道程に依存して長くなり，ときに数十秒に達した。終末グリアATP受容体P2Y2の遮断剤suraminは，前者のタイプの信号伝播だけを阻害した。槍型感覚終末間をつなぐグリア網のCa信号は，ATPの細胞外拡散に基づく比較的早い伝播と細胞内信号物質の移動による遅い伝播の2重様式を示し，両者はそれぞれ，異なる細胞活動の調節に役立つと推測される。
右田 啓介，趙 玉梅，桂木 猛（福岡大・医・薬理）
【背景】ATPは様々な刺激により細胞外に放出される。我々はアデノシン刺激によりMDCK細胞からATPが放出されることを報告した。アデノシン刺激は，A1受容体を介してホスホリパーゼCを活性化し，細胞内IP3を介して細胞内カルシウム(Ca2+)ストアーからCa2+が放出され，細胞外にATPが放出される。しかしながら，細胞内Ca2+上昇後のメカニズムについては明らかではない。そこで，本研究ではアデノシン刺激による細胞内Ca2+上昇後のATP放出経路および放出部位について検討した。
【方法】アデノシン刺激により灌流液中に放出されたATP量は，ルシフェリン・ルシフェラーゼを用いて測定した。また，灌流実験により，ミトコンドリアCa2+ 指示薬のRhod2/AMおよびミトコンドリアマーカーのMitoTracker Green FMを用いて，ミトコンドリア内Ca2+変化を測定した。
【結果および考察】MDCK細胞への10mMアデノシン刺激は，ATPの細胞外放出を引き起こした。この放出は，ミトコンドリアのADP/ATPトランスポーター拮抗薬(10mM carboxyatractyroside，10mM bongkrekic acid，50mM N-Ethylmaleimide)，Na+/Ca2+交換輸送体拮抗薬(20mM CGP 37157)あるいは酸化的リン酸化拮抗薬(10mM CCCP，10mM oligomycin)の前処置により強く抑制された。また，抗癌剤の細胞外放出に関与しているMultidrug
resistant protein(MRP)の拮抗薬(5 mM MK571，100mM glibenclamide，10mM benzbromarone，100mM probenecid，10mM cyclosporine A)の前処置により，アデノシンによるATPの細胞外放出はほぼ完全に抑制された。これらの結果から，MDCK細胞へのアデノシン刺激は，A1受容体を介し細胞内Ca2+上昇の後，ミトコンドリアにシグナルが伝えられ，細胞膜のMRPを介してATPが細胞外に放出されることが示唆された。
市川 純，玄番 央恵（関西医科大学・第2生理）
【要旨】ラット骨髄間質細胞はP2Y2受容体を発現し，UTPに反応して細胞内カルシウム上昇を起こす。F344雄ラット大腿骨骨髄より採取した骨髄間質細胞を培養し，Fura-2を用いて細胞内カルシウム濃度測定を行った結果，細胞密度によってカルシウム応答の様子が異なることがわかった。細胞密度を低・中・高と3段階にわけて観察すると，高密度であるほどUTPに反応しやすい。一方，低密度ではUTPに対する反応は鈍いが，カルシウムストアの枯渇により起こる容量性のカルシウム流入は大きい。そしてその中間の密度では，UTP投与によりカルシウムオシレーションがみられた。このオシレーションは細胞外カルシウム除去により減衰し，また外液UTPをwashoutするとただちに消失した。オシレーションの頻度は容量性カルシウム流入チャネルのブロッカーおよびギャップジャンクションのブロッカーにより変動した。このUTPによるカルシウムオシレーションは低密度および高密度の状態ではみられないことから，骨髄間質細胞が細胞間コミュニケーションを形成する際，一過性に起こる現象であると考えられる。
小林 希実子，福岡 哲男，山中 博樹，野口 光一（兵庫医科大学・解剖学第2講座）
ATP受容体としてイオンチャネル型受容体のP2X receptor (P2X1-7)とGタンパク共役型受容体のP2Y receptorが存在しており，これらの受容体が痛みに関与していることが近年報告されている。
我々は，これまでにP2X receptor, P2Y receptor のnaiveラット後根神経節(DRG)における詳細な発現の解析を行い，各サブタイプ別の特異的な発現パターンを報告してきた。DRG neuronにはP2X2-6が発現しており，P2X2，P2X3 receptorは小型・中型neuronに，P2X5，P2X6 receptorは中型・大型neuronに，P2X4 receptorはほとんど全てのneuronに発現しており，さらにnon- neuronal cellにはP2X4，P2X6，P2X7 receptor の発現が見られた(Kobayashi et. al. J.
Comp. Neurol. 2005)。
末梢神経損傷後の痛みにP2X受容体がどのように関わっているかを調べるために，坐骨神経切断モデルを用いてDRGにおけるP2X
receptorの発現の変化をin situ hybridization法を用いて詳細に検討した。
その結果，末梢神経損傷後のDRGではP2X受容体の発現に変化が見られた。最も発現の多いP2X3 receptorは発現細胞数，シグナル強度がやや減少していた。中型・大型 neuronで発現しているP2X5，P2X6は減少していた。P2X4はneuronでの発現は減少していたが satellite cellにおいて増加が見られた。P2X7は坐骨神経切断後もneuronにはほとんど存在しないがsatellite cellでの発現がやや増加していた。P2X2は坐骨神経切断後1日から増加し始め7日でピークに達し，60日まで増加したままであった。また，P2X2は健側では小型・中型に発現しているが，術側で発現の増加が見られたneuronは主に中型細胞であった。
以上のことから，末梢神経損傷後のDRG neuronにおいては主にP2X2，P2X3 receptorが存在していることが分かった。健側のDRGではP2X2とP2X3の共存は比較的少なく，一方術側においてこの2つのサブタイプが共存を示す可能性が示唆されたことで，神経損傷後のヘテロ受容体による痛覚過敏のメカニズムとして興味深い。
藤下 加代子1，末石 浩二1,2，井上 和秀3，小泉 修一1
（1国立衛研・薬理部，2福岡大学・薬・薬学疾患管理，3九州大学・院・薬・薬効解析）
脳内におけるアストロサイトの生理学的，かつダイナミックな役割に注目が集まっている。特にニューロンを取り巻くアストロサイトは三者間シナプスを形成し，シナプスから漏れ出た伝達物質を受け取るだけでなく，自らも液性因子を放出し，シナプス伝達を制御することが知られてきている。他方でアストロサイトは，その足 (endfoot)を血管系に伸ばし，血管壁の周りを取り巻くことが知られている。血管系のうち，毛細血管や微小血管の血管壁外周にはペリサイト（周皮細胞）と呼ばれる細胞が存在しているが，その脳内における機能や役割についてはまだ明らかになっていない。
私達は今回，このアストロサイト−ペリサイト−血管系連関に注目し，ペリサイトにおけるATP/P2受容体を介したシグナルの生理学的な役割及びアストロサイト−ペリサイト間におけるATP/P2受容体を介したコミュニケーションについて検討を行なった。
ラット初代培養ペリサイトを用いた薬理学的な検討から，ペリサイトにはP2Y1，P2Y2，P2Y4受容体が発現しており，中でも主として機能しているP2受容体は P2Y2受容体であると考えられた。そこで，ペリサイトを種々のアゴニストで灌流刺激し，細胞の収縮/弛緩を測定したところ，UTP及び2MeSADPでペリサイトの収縮が観察された。続いて，収縮/弛緩の実験モデルとして，単一のペリサイトにガラスピペットを用いて機械刺激を与えたところ，まず被刺激細胞で細胞内 Ca2+濃度([Ca2+]i)上昇が起こり，それが周囲のペリサイトへ，Ca2+ wave となって伝播した。このCa2+ wave伝播は，apyrase及びP2受容体アンタゴニストによりほぼ抑制された。また，luciferin-luciferase法に基づくフォトンカウントを行なった結果，ペリサイトから，機械刺激に応じてATPが放出されることが明らかとなった。
脳表の比較的太い血管と異なり，脳深部の微小血管・毛細血管はアストロサイトの強い支配を受けており，このアストロサイトも強いATP放出能を有する。従って，血管周囲のペリサイトは，自ら放出したATP及びその周囲を取り囲むアストロサイト由来ATPを受容することによりその収縮・弛緩，さらに局所血流量を調節している可能性示唆された。また，アストロサイト−ペリサイト共培養系を用いた検討から，ペリサイトで発生した Ca2+wave が細胞外ATP及びP2受容体依存的に，近隣のアストロサイトへも伝播することを明らかとした。従って，血管系の収縮・弛緩といった物理的なシグナルがATPの化学シグナルに変換されてアストロサイトへフィードバックされる可能性も示唆された。
多田 薫1，戸崎 秀俊1，井上 和秀2，小泉 修一1
（1国立医薬品食品衛生研究所 薬理部，2九州大学 大学院 薬学研究 院薬効解析学分野）
Pinocytosisは，細胞外液やそこに溶解する分子を細胞膜により取り囲み，小胞として細胞内に取り込む飲作用であり，全ての細胞において無刺激状態でも絶えず行われている（恒常的pinocytosis）。Pinocytosisの生理的役割として，栄養分子やイオンなどの取り込み，有害物質の除去，細胞膜面積の調整など多くの可能性が示唆されているが，その機構について詳細はまだ明らかになっていない。一方，P2Y6受容体はUDP選択的pyrimidinoceptorであり，その発現は免疫系細胞，脳，肺，心臓，血管など多くの部位に認められ，アストロサイト上での発現も報告されているが，その生理的役割は未だによく解っていない。そこで今回我々は，アストロサイトのpinocytosisにおけるP2Y6受容体の関与について検討した。
ラット初代培養アストロサイトの細胞外に蛍光標識ビーズを添加すると，時間依存的に蛍光が細胞内へ取り込まれることがflow cytometryや蛍光顕微鏡により観察されたことから，アストロサイトにおいて恒常的pinocytosisが起こっていることが明らかになった。一方，この反応は，reactive blue-2前処置により部分的に抑制されたことから，一部プリン受容体（特にP2Y）の作用を介している可能性が考えられた。そこで，pinocytosisに対する各種P2受容体アゴニストの作用を検討したところ，UDPによってpinocytosisの促進が観察されたことから，P2Y6受容体が関与することが示唆された。実際，アストロサイトには機能的なP2Y6受容体が発現することをCa2+レスポンス及びWestern blottingにより確認した。次に恒常的pinocytosisに対するP2Y6受容体の関与について，P2Y6受容体に対するアンチセンスヌクレオチド及びP2Y6受容体アンタゴニストMRS2578を用いて検討した。その結果，アストロサイトにおける恒常的pinocytosisは，それらの処置により部分的ながら(20〜25%)阻害された。一般的に，受容体はアゴニスト刺激により細胞内へ内在化を起こすことが知られている。そこで，UDP刺激により生じるpinocytosisがP2Y6受容体の内在化によるものか否かについて検討した。まず，N末にFLAG標識したFLAG-P2Y6受容体をヒトアストロサイトーマ1321N1細胞上に発現させ，UDPで刺激するとpinocytosisが促進した。次に，UDP刺激後のFLAG-P2Y6受容体の内在化について，抗FLAG抗体を用いたlive-labelling法で検討した結果，UDP刺激でpinocytosisが促進されている1321N1細胞においても，FLAG-P2Y6受容体の内在化の程度は無刺激の状態と殆ど変わらなかった。以上より，P2Y6受容体を介するpinocytosisはP2Y6受容体の内在化に起因するものではないことが明らかになった。
本研究により，アストロサイトにおいて恒常的なpinocytosisが起こっていること，更にこの反応には部分的ながらP2Y6受容体が関与することが示唆された。これは，アストロサイトが自発的にヌクレオチドを放出する事実と合わせて考察すると興味深い。
藤原 祐一郎，久保 義弘（生理研 神経機能素子）
Activity regulation by
phosphoinositides (PIPns) are known for various ion channels. In
this study we aimed to examine whether the ATP-gated P2X2 receptor
channel is also regulated by PIPns or not, and analyzed the
electrophysiological properties of P2X2 wild type expressed in Xenopus
oocytes under two-electrode voltage clamp. We observed
that the preincubation in wortmannin or LY294002, PI3K inhibitors, accelerated
the channel desensitization, while the
preincubation in PAO, a PI4K inhibitor, decelerated it. As all PIPns
are anionic lipids, we focused as the structural determinant on the proximal
region of the C-terminus cytoplasmic domain where positively charged amino
acids are clustered. We analyzed properties of several mutant P2X2
channels, and observed that K360Q, K365Q, K369Q, R371Q or K374Q mutation
accelerated the desensitization, while K365R or K369R mutation did not. These
results suggest that these positively charged amino acid residues play critical
roles in preventing the channel desensitization. As a next step we purified a
GST-tagged recombinant protein from L353 to S377 expressed in E. coli., and
analyzed their binding to anionic lipids using a PIPns-coated
nitrocellulose membrane. We observed that the recombinant protein including the
positively charged region was bound to PIPs
and PIP2s, and that the bindings were eliminated by the K365Q or
K369Q mutation. We also confirmed that a fusion protein between EGFP and the
proximal C-terminus cytoplasmic domain of P2X2 closely associated
with the plasma membrane using a fluorescence assay. Taken together, we
speculate that an electrostatic binding of the membrane PIP2 to the
proximal C-terminus cytoplasmic domain plays a critical role in maintaining the open channel
activity.
片山 貴博，南 雅文（北大院・薬・薬理学分野）
ケモカインは白血球に対して走化活性化作用を有する一群のサイトカインの総称であり，現在までに50種近くが同定されている。Monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1，CCL2)は代表的なケモカインの1つであり，脳虚血や多発性硬化症，ウイルス感染など，様々な病理的条件下の脳内で産生誘導され，脳細胞傷害増悪への関与が示唆されている。一方，脳切片培養系は細胞構築や個々の細胞の活性化状態が単離分散培養系や共培養系と比較してよりin vivoに近い状態にあるため，活性化状態の違いによって様々な挙動を示すグリア細胞の研究に有用であると考えられる。我々はこの脳切片培養系を用いて，ATPgS処置によりアストロサイトにおいて一過性にMCP-1産生誘導が惹起されることを見いだしている。MCP-1産生誘導に関する細胞内情報伝達については，MAPキナーゼの関与を示す多くの研究がなされているが，刺激および細胞種によって，その寄与の方向性や度合いは様々である。そこで本研究では，ATPgSによるMCP-1産生誘導におけるMAPキナーゼの関与について脳切片培養系を用いて検討を行った。
生後2-3日齢Wistar/STラットより，大脳皮質−線条体領域からなる冠状切片（300mm厚）を作製し，10-11日間培養後，実験に用いた。ATPgS処置24時間後の培地中へのMCP-1遊離量は，MEK阻害薬PD98059およびJNK阻害薬SP600125により有意に減少し，逆にp38 MAP kinase阻害薬SB203580によって増加した。一方，3時間のATPgS処置直後のmRNA発現に関して検討したところ，PD98059およびSP600125は発現抑制効果を示したが，SB203580はmRNA発現に影響を与えなかった。そこでSB203580のMCP-1 mRNA発現およびタンパク産生に対する効果を経時的に検討したところ，ともにSB203580存在下では非存在下に比べ，mRNA発現やタンパク産生の持続時間が延長された。
以上の結果より，脳切片培養系においてATPgSによるMCP-1産生誘導に関して，ERKおよびJNKは転写レベルで促進的に調節していると考えられた。また，p38 MAPキナーゼを介した抑制的な調節機構の存在も示された。
