生理学研究所年報(第27巻)

生理学研究所年報　第27巻
研究会報告

14．シナプスの一生：誕生・維持・除去過程の統合的理解に向けて

2005年12月1日－12月2日
代表・世話人：柚﨑通介（慶應義塾大学　医学部　生理学）
所内対応者：重本隆一（自然科学研究機構　生理学研究所　脳形態解析）

（１）: Novel role of CaMKII in the maintenance and regulation of synaptic structure
林　康紀（理研-MIT Neuroscience Research Center）
（２）: Experience-driven synaptic delivery of AMPA receptors in vivo

高橋　琢哉 (Cold Spring Harbor Laboratory, Neurobiology)
（３）: リン酸化によるNMDA受容体局在調節とシナプス可塑性の制御

渡部　文子（東京大学医科学研究所　神経ネットワーク）
（４）: 後シナプスニューレキシンのシナプス形成における抑制的役割

谷口　弘樹(Cold Spring Harbor Laboratory, Neurobiology)
（５）: NMDA受容体細胞外ドメインの新たな役割

加藤　明彦(Eli Lilly)
（６）: シナプス形成におけるネクチンの役割

匂坂　敏朗（大阪大学大学院医学系研究科　分子生物学）
（７）: プレシナプスアクティブゾーンにおけるリン酸化プロテオーム

大塚　稔久（富山大学医学部　臨床分子病態学）
（８）: ショウジョウバエ嗅覚地図の構築におけるNotchコードの役割

遠藤　啓太（発生・再生科学総合研究センター　神経回路発生）
（９）: 神経伝達物質放出量の制御機構の一考察

高森　茂雄（東京医科歯科大学　医歯学総合研究科　脳神経病態学）
（10）: NR2Bリン酸化残基改変マウスの情動異常の解析

デラワリ　ミナ（東大医科学研究所　癌細胞シグナル研究分野）
（11）: Rab3 GAPによるシナプス伝達と可塑性の制御

坂根亜由子（徳島大　ヘルスバイオサイエンス　分子病態学）
（12）: Translocation of drebrin and F-actin from dendritic spines to shafts was regulated by myosin II ATPase activity

水井利幸（群馬大学医学系研究科　高次細胞機能学）
（13）: ATP受容体チャネルP2X2の膜電位とATPに依存した"ゲート"機構の解析

藤原祐一郎（自然科学研究機構　生理学研究所　神経機能素子研究部門）
（14）: Quantitative analysis of GABAA receptor subunits expressed in hippocampal CA1 pyramidal cells by SDS-digested freeze-fracture replica labeling (SDS-FRL)

春日井　雄（自然科学研究機構　生理学研究所　脳形態解析部門）
（15）: Quantitative analysis of AMPA and NMDA receptors in the retino- and cortico-geniculate synapses as revealed by SDS-digested freeze-fracture replica labeling (SDS-FRL)

足澤悦子（自然科学研究機構　生理学研究所　脳形態解析部門）
（16）: 突起形態における樹状突起局在性転写コアクチベーターMALの役割

田渕明子（富山大学薬学部・分子神経生物学研究室）
（17）: 新しい分泌性シナプス機能修飾因子セレブリンファミリーの解析

飯島崇利（慶應義塾大学　医学部　生理学）

【参加者名】
安部健太郎，遠藤啓太（理化学研究所・発生再生科学総合研究センター），飯島崇利，石田　綾，掛川　渉，亀川雄一，幸田和久，田川義晃，松田恵子，松田信爾，柚崎通介（慶應義塾大学　医学部），飯田純子，井上明宏，岡部繁男，高森茂雄，畑　裕（東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科）石井　裕，久保義弘，重本隆一，篠原良章，立山充博，中條浩一，長友克広，挾間雅章，深澤有吾，藤原祐一郎，山肩葉子（生理学研究所），井上英二（カン研究所），大塚稔久，田渕明子，所　崇，比嘉　進，山口桂司（富山大学医学部），片岡正和（信州大学工学部），加藤明彦（Eli Lilly），狩野方伸，橋本浩一（大阪大学大学院医学系研究科），小林静香，関野祐子，デラワリ　ミナ，中澤敬信，真鍋俊也，渡部文子（東京大学医科学研究所），齊藤　実（東京都医学研究機構東京都神経科学総合研究所），坂根亜由子，佐々木卓也（徳島大学大学院ヘルスバイオサイエンス研究部），匂坂敏朗（大阪大学大学院医学系研究科）崎村建司，武井延之（新潟大学脳研究所），白尾智明，水井利幸（群馬大学大学院医学系研究科），瀬藤光利（岡崎統合バイオサイエンスセンター），高雄啓三（京都大学医学研究科），高岸芳子（名古屋大学環境医学研究所），高橋琢哉，谷口弘樹（Cold Spring Harbor Laboratory），竹居光太郎（横浜市立大学医学部），林　康紀（RIKEN-MIT Neuroscience Research Center），尾藤晴彦（東京大学大学院医学系研究科），平井宏和（金沢大学学際科学実験センター），本田知之（三重大学大学院医学系研究科），山田麻紀（東京大学薬学系研究科）

【概要】
　脳を構成する1000億個を超える神経細胞は，特異的なシナプス結合によって情報を伝達すると同時に，シナプスにおいて記憶を蓄えると考えられている。個体の発達と共に誕生した新たなシナプスは，環境要因や学習過程に応じて特定のシナプスのみが選択的に強化され，さまざまな分子が集合して成熟し，一部のシナプスは除去されていく。近年，このようなシナプスの形成・維持・除去過程は，発達段階の脳のみならず，個体の一生を通じてダイナミックに起きる現象であることが明らかになってきた。このようなシナプスの形成・維持過程の分子的基盤の解明は，児童期・青年期における教育・学習効果に関する理論的知見を与え，老化に伴う記憶の障害機構を理解するための重要な鍵を与えると期待される。この一連の過程の分子機構を解明していくためには，分子生物学，生化学，生理学，解剖学，細胞生物学，遺伝学，システム脳科学などの異なる分野の人材による学際的なアプローチとその統合が不可欠である。そこで，本研究会では，広く他分野の研究者を集め，情報交換と交流を図ることを目的とし，演題(1)-(9)では，最先端で活躍中の演者を交えて一演題当たり一時間程度の十分な時間をかけて，徹底的な討論を行った。また若手研究者の育成を図るために，演題(10)-(17)は若手研究者がポスターを用いて，やはり十分な時間をかけて討論した。これらの討議のプロセスにより，解決可能な新規の問題点を洗い出し，今後の領域横断的な研究のシーズを見出すことができたと考えている。

（1）　Novel role of CaMKII in the maintenance and regulation of synaptic structure

林　康紀（理研-MIT Neuroscience Research Center）

　The synapse is a highly organized cellular specialization that reorganizes its structure and composition according to input strength-both positively and negatively. The mechanisms orchestrating these changes remain largely elusive. We previously reported that activity dependent bidirectional regulation of actin at the synapse is involved in postsynaptic assembly-disassembly, and serves as a substrate for bidirectional synaptic plasticity. Tetanic stimulation rapidly and persistently shifts the F-actin/G-actin equilibrium towards F-actin in dendritic spines. The molecular mechanism involving this regulation has not yet been discovered.

　We have hypothesized that CaMKII, a serine/threonine protein kinase highly enriched in excitatory synapses, is involved in this regulation. Here we present experimental evidence suggesting that CaMKII has a structural role in stabilizing actin cytoskeleton in dendritic spines.

（2）　Experience-dependent synaptic delivery of AMPA receptors in vivo

高橋　琢哉（Cold Spring Harbor Laboratory, Neurobiology)

　TThe molecular modifications that occur in the intact vertebrate brain as a consequence of experience are still poorly understood. One crucial question is whether natural stimuli in vivo induce the synaptic delivery of GluR1.

　To test this, I injected Sindbis virus carrying recombinant AMPA receptors into barrel cortex of rats with or without whiskers in vivo at P12, an age characterized by rapid experience-dependent development of barrel cortex circuitry. 2 days later, I cut acute slices and tested delivery of AMPA receptors to synapses from layer4 to layer2/3 pyramidal neurons with an electrophysiological technique. I found that recombinant and endogenous GluR1 were delivered to synapses in the intact whisker rats but not in the deprived whisker rats. This showed that synaptic delivery of GluR1 is experience-dependent. In vitro experiments showed that synaptic delivery of GluR2 is activity-independent. Consistent with these in vitro results, recombinant and endogenous GluR2 were delivered to synapses both in the intact and deprived whisker rats. So the model, which was developed from in vitro experiments, applies toexperience-dependent plasticity in vivo.

（3）　リン酸化によるNMDA受容体局在調節とシナプス可塑性の制御

渡部　文子（東京大学医科学研究所　神経ネットワーク）

　神経伝達効率の長期増強(LTP)にはNMDA型グルタミン酸型受容体(NMDAR)が重要な役割を担うことが知られているが，生理的条件下でNMDAR機能がどのように調節されているのかに関しては不明な点が多い。LTP誘導刺激をはじめ，虚血やエタノール暴露など様々な系においてNMDARのリン酸化が報告されており，生理的に多様な機能を担っていることが示唆されている。

　そこで我々はNR2Bの主要なリン酸化部位である1472番目チロシン残基に変異を導入したノックインマウス (YF) の詳細な解析を行うことにより生体内での役割を検討した。免疫電顕による解析で野生型マウス(WT) ではNMDARはシナプス後肥厚部の中心部分に偏って局在しているがYFでは均等に近く散在していた。またYFの扁桃体ではNR2Bとa-アクチニンとの結合が顕著に減弱していた。一方YFではNMDA/AMPA電流比，AMPA電流のmEPSCの大きさや頻度にも有意な差は無かったが，LAにおけるLTPは有意に減弱しており，また恐怖条件付け学習行動にも障害が見られた。LTP誘導刺激によるNMDA電流の加算に変化は見られなかったが，YFの扁桃体ではNR2BとCaMキナーゼIIとの結合が顕著に減弱していた。これらの結果からこのリン酸化は受容体の局在や下流シグナル系を制御することにより，シナプス可塑性の誘導や学習行動も制御している可能性が示唆された。

（4）　後シナプスニューレキシンのシナプス形成における抑制的役割

谷口　弘樹(Cold Spring Harbor Laboratory, Neurobiology)

　シナプスは神経細胞同士の信号伝達を仲介する場所であり，その形態的，機能的変化は学習記憶の基盤メカニズムと考えられている。よってシナプス形成を制御するメカニズムを解明することは発生生物学的見地からのみならず，脳機能を理解する上でも重要かつ興味深い課題となっている。本研究では，シナプス形成を抑制する分子の同定，その機能解析を目的とした。NLGは培養海馬神経細胞に発現すると顕著な前シナプス誘導活性を示すので，スクリーニングの指標として有用であると考えた。そこで，NLGと候補分子を共発現し，NLGの活性を阻害する分子を目的のものとした。その結果，興味深いことにNLGの受容体であるNrx1betaがそのような阻害活性を持つことがわかった。pan-Nrx抗体を用いた，免疫細胞染色，免疫電子顕微鏡の解析から，Nrxは前シナプスばかりではなく，後シナプスにも存在することが明らかになった。また，NLGとシスで共存するNrx1betaは，NLG-Nrx1beta間のトランス相互作用を阻害することが明らかになった。さらに興味深いことにNrx1betaの培養海馬神経細胞における過剰発現はNLGタンパクの発現増加を誘導することもわかった。以上の結果をふまえ，後シナプスNrx1betaのシナプス形成における抑制的役割について議論したい。

（5）　NMDA受容体細胞外ドメインの新たな役割

加藤　明彦 (Eli Lilly)

　NMDA受容体はシナプス可塑性，過剰な興奮による神経細胞死に関わる最も重要なイオン透過性グルタミン酸受容体である。イオン透過性グルタミン酸受容体は細胞外ドメイン，膜貫通ドメイン，細胞内ドメインからなる。細胞外ドメインは，リガンド結合ドメインのほかに400アミノ酸からなる N-terminal domain (NTD)が存在する。NTDは最も大きなドメインであるにもかかわらず，機能解析は立ち遅れている。

　私どもはNMDA受容体の必須サブユニットである，NR1のNTDと相互作用する分子を同定することを通してNTDの機能を探ることを試みた。Alkaline phosphataseと融合したNR1-NTDを哺乳動物細胞から分泌させ，これをプローブに用いて海馬の初代培養を染色したところ，神経細胞で強いシグナルが得られた。このことは海馬にNR1-NTDと結合する分子が存在することを示している。次いで，発現クローニングを用いてNR1-NTDと結合する分子の同定を行ったところ，ユビキチンリガーゼの基質特異性を決定するF-boxタンパクのひとつ，Fbx2であることが分かった。Fbx2は糖タンパクと結合してユビキチン化することが報告されている。実際，NR1はFbx2と，high mannoseタイプの糖鎖依存的に結合してユビキチン化されることを見出した。このことは，NR1のNTDがいったんlumen側ないし，細胞外に出た後，再度細胞質側に戻り，ユビキチン化されて分解されるという，「retro-translocation」を受けていることを示している。

　さらに興味深いことに，Fbx2のdominant negativeを海馬神経細胞に導入すると，神経活動依存的にNR1の免疫染色強度が増加することに加え，細胞表面のNMDA受容体を介する電流が増加することを見出した。このことから，NR1の細胞外ドメインを介したFbx2によるユビキチン化が，機能的なNMDA受容体の数を減らす役割を果たしているのではないかと考えている。

（6）　シナプス形成におけるネクチンの役割

匂坂　敏朗（大阪大学大学院医学系研究科　生化学　分子生物学）

　神経シナプスはニューロン間の特殊な細胞間接着であり，その特異性と可塑性は細胞間接着分子により制御されている。その形は，海馬CA3領域において，神経伝達の場(synaptic junction (SJ))を中心に，その周りをシナプスの機械的な接着(puncta adherentia junction (PAJ))が取り囲むという同心円状の形をしている。PAJは，上皮の細胞間接着と同様に，前，後シナプス膜が対称的な形態を保っており，細胞間接着分子が集積している。このPAJには，イムノグロブリン系細胞間接着分子であるネクチン-1が前シナプス膜にネクチン-3が後シナプス膜に非対称性に局在している。また，ネクチンの結合タンパク質であるアファディンとN-カドヘリンは対称性にPAJに局在している。そこで，PAJにおけるネクチンの機能を調べるために，ネクチン-1とネクチン-3のノックアウトマウスを作成した。両方の変異マウスにおいて，PAJの数が減少していた。さらに，苔状線維の走行異常が認められた。これらの結果から，ネクチンはPAJの形成に関与していて，またそれにより苔状線維の走行を維持していることが考えられた。

（7）　神経シナプス・アクティブゾーンにおけるリン酸化プロテオーム

大塚　稔久（富山大学医学部　臨床分子病態学講座）

　神経伝達物質を含有したシナプス小胞は，活動電位による刺激によりカルシウムイオンが流入すると，プレシナプスの形質膜と融合し神経伝達物質をシナプス間隙に放出する。この一連のステップは，特異的な場であるアクティブゾーンにおいて厳密に制御されている。

　アクティブゾーンを構成する蛋白質群としてはBassoon，Piccolo，RIM，Munc13-1，および私共が見いだしたCASTおよびELKSが知られている。なかでも，CAST/ELKSファミリーは，他のアクティブゾーン蛋白質と相互作用することにより，アクティブゾーンにおいて巨大な蛋白質複合体を形成している。さらに，この複合体は静的なものではなく，非常にダイナミックで，神経伝達物質の放出においても重要な役割を担っている。

　私共は，最近，神経終末においてユニークな局在を示すセリンスレオニンキナーゼを同定した（SADキナーゼ）。本セッショントークでは，このSADキナーゼの機能解析のデータを中心に紹介し，アクティブゾーン形成とその機能発現におけるリン酸化シグナル伝達機構の役割について議論したい。

（8）　ショウジョウバエ嗅覚地図の構築におけるNotchコードの役割

遠藤　啓太（理化学研究所　発生・再生科学総合研究センター　神経回路発生研究チーム）

　キイロショウジョウバエの嗅覚神経系では，脊椎動物の嗅覚神経系同様，特定の嗅覚受容体を発現する嗅覚神経細胞が脳内の一次嗅覚中枢である嗅覚葉（脊椎動物の嗅球に相当）の特定の糸球体へ軸索を投射している。我々は，この特異的な軸索投射に関わる遺伝子の同定を目的とし，嗅覚神経細胞の軸索投射に異常を示す突然変異のスクリーニングを行った結果，Notchタンパクが下流の遺伝子を活性化する際に必要な核内因子をコードするmastermind遺伝子の変異を分離した。

　この変異をもつ嗅覚神経細胞は一部の特定の糸球体へのみ軸索を投射し，反対に，Notchシグナルに対して抑制的に働くnumb遺伝子の変異をもつ嗅覚神経細胞は，これとは相補的な糸球体へのみ軸索を投射する。また，これらの変異をもつ嗅覚神経細胞は，それぞれ特定の，かつ，相補的なセットの嗅覚受容体のみを発現する。したがって，嗅覚神経細胞の発生運命が Notchシグナルの ON/OFFによって大きく二分され，その運命に従って軸索投射の特異性が制御されていることが明らかになった。

　 Notch ON/OFF それぞれの発生運命をもつ嗅覚神経細胞が軸索を投射する領域は嗅覚葉内で大きく分かれている。また，それぞれの領域は投射する軸索の走行パターンに基づいて更に複数のドメインへと分けることができる。したがって，Notch ON/OFFに従った軸索投射機構が，嗅覚神経細胞のもつ他の遺伝情報と組合わさることによって嗅覚神経系全体の回路構築に寄与していることが示唆された。

（9）　神経伝達物質放出量の制御機構の一考察

高森　茂雄（東京医科歯科大学　医歯学総合研究科　脳神経病態学）

　グルタミン酸は哺乳類神経系の主要な興奮性神経伝達物質である。ニューロンがグルタミン酸を放出するためには，神経終末の細胞質に存在するグルタミン酸がシナプス小胞内に輸送される必要がある。この重要な過程を担う膜蛋白質が小胞型グルタミン酸トランスポーター(VGLUT)である。2000年のVGLUT1の同定を契機に，現在までに，3つのVGLUTイソ型が同定され，VGLUTを分子指標とした脳内のグルタミン酸神経回路が刻々と明らかになってきた。興味深いことに，哺乳類脳内では，VGLUT1とVGLUT2が相補的な分布を示す。また，VGLUT3は，これまでグルタミン酸作動性ニューロンとは考えられていなかったニューロンに発現しており，その生理学的な意味は謎である。更に最近になって，統合失調患者や虚血モデル動物などで，脳部位特異的なVGLUTイソ型発現量の変化が誘起されることが報告され，VGLUT発現量に伴うシナプス伝達強度の変化の生理学的な意義や病態への関与などが示唆されている。今回は，VGLUT分子同定の経緯を概説すると共に，VGLUTに着目したグルタミン酸神経回路の分子多様性・VGLUTのシナプス伝達強度への影響など，最近の知見を交えて総括的に紹介する。

（14）　Quantitative analysis of GABAA receptor subunits expressed in hippocampal CA1 pyramidal cells by SDS-digested freeze-fracture replica labeling (SDS-FRL)

春日井　雄（自然科学研究機構　生理学研究所　脳形態解析部門）

（15）　Quantitative analysis of AMPA and NMDA receptors in the retino- and cortico-geniculate synapses as revealed by SDS-digested freeze-fracture replica labeling (SDS-FRL)

足澤悦子（自然科学研究機構　生理学研究所　脳形態解析部門）

（16）　突起形態における樹状突起局在性転写コアクチベーターMALの役割

田渕明子（富山大学薬学部・分子神経生物学研究室）

（17）　新しい分泌性シナプス機能修飾因子セレブリンファミリーの解析

飯島崇利（慶應義塾大学　医学部　生理学）



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