2006年9月7日−9月8日
代表・世話人：南雅文（北海道大・薬・薬理学）
所内対応者：井本敬二（神経シグナル）
- （１）
- 血管内皮細胞のATP分解酵素活性におよぼす炎症性サイトカインの影響
松岡功，唐燕＊（高崎健康福祉大学・薬学部・薬効解析，＊福島医大・医・薬理）
- （２）
- 血管周皮細胞（ペリサイト）−ATP/P2 受容体シグナルを介したアストロサイト−毛細血管連関−
藤下加代子1，末石浩二1,2，片岡泰文2，井上和秀3，小泉修一1
（1国立衛研・薬理部，2福岡大学・薬・薬学疾患管理，3九州大学・院・薬・薬効解析）
- （３）
- カルシウムストアに存在するBKチャネルによるカルシウム放出の制御
山下勝幸（奈良医大・第一生理）
- （４）
- 新規P2Xスプライシングバリアントを用いたサブユニット相互作用の解析
輿水崇鏡1，上野晋2，柳原延章2，辻本豪三1
（1京都大学薬学研究科ゲノム創薬科学分野，2産業医科大学医学部薬理学講座）
- （５）
- 細胞膜上におけるP2X4受容体の動態の1分子ビデオイメージング解析
小林 剛1，武田美江1，Fernando Lopez-Redondo2，古家喜四夫2，
山本希美子3，安藤譲二3，曽我部正博1,2
（1名古屋大・医・細胞生物物理，2JST・SORST・細胞力覚プロジェクト，
3東京大院・医・医用生体工学講座システム生理学）
- （６）
- 神経・グリア機能解析のための分子イメージング研究
渡辺恭良（理化学研究所分子イメージング研究プログラム，
大阪市立大学大学院医学研究科システム神経科学）
- （７）
- 分子イメージングによる脳虚血病態のニューロン・グリア機能解析
久下裕司（京都大学大学院薬学研究科・病態機能分析学分野）
- （８）
- 神経伝達物質受容体リガンドの論理的設計とその薬理活性
周東智（北海道大学薬学研究院・創薬有機化学研究室）
- （９）
- 個体レベルでのニューロン・グリア機能解析に資するイメージング法の開発
永井健治（北海道大学・電子科学研究所・ナノシステム生理学研究分野）
- （10）
- 2光子顕微鏡を用いたin vivoグリア細胞のカルシウム動態解析
高田則雄，平瀬肇（理化学研究所脳科学総合研究センター）
- （11）
- ATPによるミクログリア突起運動調節
−脳スライス培養を用いたリアルタイムイメージングによる解析−
南雅文（北海道大学大学院薬学研究院 薬理学研究室）
- （12）
- 脊髄ミクログリアにおけるグルタミン酸トランスポーター機能制御に対するATP受容体の役割
森岡徳光，Md Joynal Abdin，北山友也，森田克也，土肥敏博
（広島大学大学院医歯薬学総合研究科）
- （13）
- 脊髄内P2X2/3受容体を介した長期持続性アロディニアの誘導および維持におけるグリア細胞の役割
中川貴之1，若松佳代1，前田早苗1，南雅文2，佐藤公道3，金子周司1
（1京都大学薬学研究科生体機能解析学分野，2北海道大学薬学研究科薬理学分野，3安田女子大学）
- （14）
- ミクログリアP2X4受容体の発現における細胞内情報伝達機構
津田誠，井上和秀（九州大学大学院薬学研究院薬効解析学分野）
- （15）
- 細胞外ATPの脊髄前角細胞へ及ぼす影響について
中塚映政，古賀秀剛，青山貴博，藤田亜美，熊本栄一
（佐賀大学医学部生体構造機能学講座神経生理学分野）
- （16）
- シナプス前プリン受容体の発現機能連関解析−シナプス前分子の in vivo gene silencing−
加藤総夫（東京慈恵会医科大学・総合医科学研究センター・神経生理学研究室）
- （17）
- P2X受容体を介したマウス網膜における経路特異的な応答の修飾
金田誠，石井俊行＊，重松康秀＊＊，細谷俊彦＊，霜田幸雄＊＊
（慶應大・医・生理，＊理研・脳センター・細谷研究ユニット，＊＊東京女子医大・総研）
- （18）
- Generation of adenosine A3 receptor humanized mice for the evaluation of the human antagonists
Mitsuo Satoh, Kazuya Yamano, Miho Inoue, Shigehiro Masaki, Mayumi Saki, Michio Ichimura
(Pharmaceutical Research Center, Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)
- （19）
- T細胞の分化・成熟によるP2X7受容体活性の変動
原田均，月本光俊，前畑真知子，五十里彰，高木邦明，出川雅邦
（静岡県立大・薬）
- （20）
- 受容体刺激によるPIP2減少とIP3増大の測定法の開発 −PH-GFPの代替として−
尾松万里子，藤居祐介，松浦博（滋賀医科大学・生理学講座・細胞機能生理学部門）
- （Ｐ１）
- 孤束核シナプス前P2X受容体によるシナプス伝達制御
〜laser photolysis法を用いた時間空間限局的ATP投与〜
井村泰子（東京慈恵医大・総合医科学研究センター・神経生理）
- （Ｐ２）
- 中枢シナプス前A1受容体のin-vivo遺伝子ノックダウン
繁冨英治（東京慈恵医大・総合医科学研究センター・神経生理）
- （Ｐ３）
- アデノシンA1受容体によるラット海馬スライス内興奮伝播制御
関野祐子（東京大・医科学研・神経ネットワーク）
- （Ｐ４）
- Neurotransmitters involved in thermosensation
Sravan Mandadi（生理研・岡崎統合バイオサイエンスセンター・細胞生理）
- （Ｐ５）
- FM1-43 a vital dye used to detect P2X4 channel activity
Fernando Lopez-Redondo（科学技術振興機構・細胞力覚プロジェクト）
- （Ｐ６）
- ミクログリアのP2X4受容体発現制御におけるフィブロネクチンの作用解明
豊満笑加（九州大・薬・薬効解析）
- （Ｐ７）
- 難治性疼痛におけるATP受容体を介した細胞質型ホスホリパーゼA2の活性化
長谷川茂雄（九州大・薬・薬効解析）
- （Ｐ８）
- a7ニコチン性アセチルコリン受容体のホスホリパーゼC活性化を介したミクログリアの機能調節
濱千紘（広島大・薬・薬効解析）
- （Ｐ９）
- 細胞外ATPによる海馬アストロサイト自発的カルシウム・オシレーションの頻度調節
川村将仁（東京慈恵医大・薬理）
- （Ｐ10）
- OGD-induced ATP release via maxi-anion channels in mouse astrocytes
Hongtao Liu（生理研）
- （Ｐ11）
- 乳腺組織サンプルからの機械刺激によるATP放出
古家喜四夫（科学技術振興機構・細胞力覚プロジェクト）
- （Ｐ12）
- 血管周皮細胞（ペリサイト)−ATP/P2受容体シグナルを介した
マトリックスメタロプロテアーゼ放出−
末石浩二（国立医薬品食品衛生研究所・薬理）
- （Ｐ13）
- ケラチノサイトHaCaT細胞におけるP2Y受容体を介したインターロイキン6産生機構の解析
小林大策（東北大・薬・細胞情報薬学）
- （Ｐ14）
- ATPおよびNADによる細胞死誘導機構の相違
前畑真知子（静岡県立大・薬・衛生・分子毒性）
- （Ｐ15）
- デオキシグルコースに依存したMDCK細胞へのアデニンヌクレオチドの取り込み
右田啓介（福岡大・医・薬理）
- （Ｐ16）
- マウス脳内のアデニル酸シクラーゼの内因性阻害物質 3'-AMP の産生酵素系の基礎的検討
藤森廣幸（摂南大・薬・衛生分析化学）
【参加者名】
南雅文，周東智（北海道大院薬学），永井健治（北海道大電子科学研），小林大策（東北大院薬学），伊藤政明，松岡功（高崎健康福祉大薬学），関野祐子（東京大医科研），高橋由香里，加藤総夫，繁冨英治，井村泰子，山本清文（東京慈恵会医科大），金田誠（慶應義塾大医），高田則雄（理研脳科学総合研究センター），大久保聡子，末石浩二，藤下加代子（国立医薬品食品衛生研），中田裕康（東京都神経科学総合研），柴田圭輔（星薬科大学／国立衛研），森倫範（新宿鍼灸柔整専門学校），須藤久美（昭和大学院薬学），和光未加（共立薬科大薬），今井利安（日本ケミファ研究所），佐藤光男，鈴木伸之（協和発酵工業医薬研究センター），天野賢一（持田製薬），原田均，前畑真知子（静岡県立大薬），最上秀夫（浜松医科大），志内伸光，小林剛（名古屋大院医学），水村和枝（名古屋大環境医学研），Lopez-Redondo Fernando，古家喜四夫（科学技術振興機構・細胞力覚プロジェクト），綿野智一（大阪大谷大薬学），渡辺恭良（大阪市立大院医学），藤森廣幸（摂南大薬学），尾松万里子（滋賀医科大），小林希実子（兵庫医科大），山下勝幸（奈良県立医科大），久下裕司，輿水崇鏡，中川貴之（京都大院薬学），土肥敏博，濱千紘，森岡徳光，原田佳奈（広島大院医歯薬学総合），井上和秀，上野光，岡綾香，片岡彩子，北野順子，齊藤秀俊，津田誠，豊満笑加，中村康次，長谷川茂雄，増田隆博（九州大院薬学），右田啓介（福岡大医），中塚映政（佐賀大医），長谷彩乃，檜山武史，野中茂紀，小林弘子（基生研），富永真琴，andadi Sravan（岡崎統合バイオ），Liu Hongtao，松井広，大塚岳，根本知己，和気弘明，高鶴裕介，稲田浩之，立山充博，石井裕，岡田泰伸，佐竹伸一郎，井本敬二（生理研）
【概要】
発表：口頭発表20題，ポスター発表16題
セッション1では，まず，松岡および藤下により，血管内皮細胞および脳血管周皮細胞機能の調節におけるプリン作動性シグナル伝達の役割についての発表と質疑応答がなされた。引き続き，山下，輿水，小林の発表があり，輿水および小林はイオンチャネル型ATP受容体分子と蛍光蛋白質との融合蛋白質発現系を用いた受容体機能および1分子レベルでの動態解析に関する最新の研究成果を発表した。
セッション2では，「グリア細胞活性化の可視化と分子機能解析」を主題とし，神経−グリア−血管内皮細胞機能連関の分子機構解明へのアプローチのための研究手法と最近の研究成果が紹介された。渡辺および久下は，PETなどの個体レベルでのイメージング手法の有用性と今後の展望について述べ，さらに脳虚血などの病態時のグリア細胞活性化の可視化への応用について動物実験による研究結果を中心に研究成果を発表した。周東は，イメージング研究や生化学的・薬理学的研究に必要となる情報伝達物質受容体の新規リガンドの創製法に関して，シクロプロパンをコアとして多様な官能基の立体配置を三次元的に制御する興味深い合成戦略とそれによるヒスタミンH3受容体選択的リガンドの創製ついて紹介した。永井は，分子機能イメージングに必要となる蛍光プローブ分子の創製手法とその応用例について，高田は，二光子顕微鏡を用いたインビボでのグリア細胞内カルシウム動態解析について，南は，脳スライス培養系を用いたミクログリア形態変化のリアルタイム観察について，それぞれ研究成果を発表し，質疑応答がなされた。
セッション3では，森岡，中川，津田により，痛覚過敏およびアロディニアの誘発とその持続における脊髄内プリン作動性シグナル伝達の役割を脊髄内グリア細胞機能との関連から検討した研究結果が報告され活発な討論がなされた。中塚は，脊髄前角細胞におけるATP受容体の役割について検討し，ATPがP2Y1サブタイプを介して脊髄前角細胞を脱分極させることを示した。加藤は，孤束1次求心路−2次ニューロン間興奮性シナプス伝達調節におけるシナプス前アデノシン受容体機能解析について，シナプス前分子のin vivo gene silencing 法を用いた新しい研究手法を紹介し，シナプス前アデノシン受容体を介した抑制効果について報告した。
セッション4では，金田によりマウス網膜におけるP2X2受容体を介したOFF経路特異的な情報伝達制御について電気生理学的手法による研究成果が報告された。佐藤はヒト型アデノシンA3受容体およびヒト/マウスキメラ型アデノシンA3受容体をノックインした遺伝子改変マウスの作製とそれを用いた薬理学実験の結果について発表した。興味深いことにヒト型アデノシンA3受容体は，マウスでは，アゴニスト刺激によりCa2+動員は惹起するが，PI3K経路にはカップルしないことが示された。アデノシンA3受容体を介した生体反応がCa2+動員系を介するものかPI3K経路を介するものかを個体レベルあるいは組織レベルで検討するために有用な実験動物であると考えられる。原田は，ATPによる成熟T細胞での細胞死誘導におけるP2X7受容体の役割と細胞死誘導メカニズムについて，尾松は，抗PIP2抗体を用いた免疫組織学的研究によりATPあるいはUTP刺激時の細胞膜内PIP2量変化の詳細な時間経過について，それぞれ研究成果を発表し質疑応答を行った。
以上の口頭発表に加え，16題のポスターが2日間にわたって掲示され，第2日目に1時間の討論時間が設けられて活発な意見交換がなされた。
本研究会では，口頭発表で時間が不足し討論を尽くしきれなかった感があり，今後の課題であると考えられるが，全体を通して，新しい研究成果の発表とそれに対する活発な討論が行われ，「研究者間の密な情報交換による，本邦のプリン作動性シグナリング研究のレベル向上」という本研究会の目的は十分に達成できたものと考えられる。
松岡功，唐燕＊
（高崎健康福祉大学・薬学部・薬効解析，＊福島医大・医・薬理）
細胞外のATP代謝に関わるecto-nucleotidaseは，P2受容体の刺激作用を終結させるだけでなく，細胞膜局所における迅速なアデノシン産生をもたらし，アデノシン受容体を介する作用への情報変換に重要な役割を果たしている。プリン作動性情報伝達に関与する受容体および細胞外ATP代謝酵素遺伝子が同定されて以来，ATPやアデノシンの生理的役割が数多く明らかにされてきたが，ATPやアデノシンの細胞外動態を考えるとプリン作動性情報伝達は生体の恒常性維持のみならず組織が物理的，化学的に侵襲を受けた炎症時にも重要な役割をはたすと考えられる。炎症部位では種々のサイトカイン産生が亢進し，周辺組織の細胞の遺伝子発現を変化させ，細胞応答のre-programmingが生じる。また，血小板や内皮細胞から放出されるATPやADPの分解が障害されると循環器系疾患の原因になることも明らかにされている。しかし，どのような機序でATP代謝酵素の機能変化が生じるかは知られていない。本研究では，炎症性疾患におけるプリン作動性シグナルの役割を解明する過程の1つとして，炎症反応で中心的役割を果たす内皮細胞を用いて，細胞外ATP分解酵素の発現およびATP分解活性に及ぼす炎症性サイトカインの影響を検討した。
ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) には，高活性のATP分解酵素が存在し，ATPを直接AMPに変換し，アデノシンを蓄積させた。RT-PCRにてHUVECに発現するATP分解酵素を検討した結果，ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 (CD39)とecto-5’-nucleotidase (CD73) の発現が強く，ecto-nucleotide pyrophosphatase/ phoshodiesterase 1 (NPP1) の発現も認められた。インターフェロン(IFN)-gを添加すると，ATP分解活性が減少し，逆に，AMPからアデノシンの産生が亢進した。この時，CD39の遺伝子発現が低下し，CD73の発現が上昇していたが，NPP1は変化しなかった。IFN-g の作用は用量および時間依存的に増大し，10 ng/ml，24時間の作用でCD39は対照の約30％にまで減少し，CD73は2.5倍に上昇した。このような遺伝子発現の変化は，ヒト大動脈および肺動脈内皮細胞，脳微小血管内皮細胞でも同様に認められた。CD39およびCD73の遺伝子発現の変化は，核内RNAでも生じていたことから，転写レベルで調節されていると考えられた。
IFN-g は受容体活性化によりJAKチロシンリン酸化酵素を活性化し，STAT1を介して転写調節を起こすが，同時にMAPキナーゼ，PI3キナーゼおよびホスホリパーゼCg などを活性化することが知られている。種々の情報伝達系阻害薬のうちIFN-gの作用を阻害したのはJAK-STAT1情報伝達系阻害剤のみであった。他のサイトカインではTNF-a およびIL-1b にIFN-g と同様の作用が認められたが，IFN-a，IL-6，IL-8，TGF-b などではCD39発現の変化は見られなかった。また，IFN- g とTNF- a またはIL-1 b は相乗的にCD39の発現とATP分解活性を低下させた。このような相乗効果はTNF- a とIL-1 b の間では見られなかった。
以上の結果から，IFN-g は血管内ATP分解の恒常性に影響し，炎症時のプリン作動性応答の変化に大きく関与すると考えられた。
藤下加代子1，末石浩二1,2，片岡泰文2，井上和秀3，小泉修一1
（1国立衛研・薬理部，2福岡大学・薬・薬学疾患管理，3九州大学・院・薬・薬効解析）
中枢神経系でのグリア細胞によるダイナミックな情報伝達制御に注目が集まっている。脳内では，ニューロンと密接して存在するアストロサイトがシナプスから漏れ出た伝達物質を受けとる一方，自らも液性因子を放出してシナプス伝達を制御する。このような，所謂「三者間シナプス」の形成には，ATP及びP2受容体が中心的な役割を果たしている。他方でアストロサイトは，その足 (endfoot) を血管系にも伸ばしている。最近アストロサイトによる血流制御に関する報告がいくつかなされたが(Zonta et al., 2003; Mulligan & MacVicar, 2004; Takano et al., 2006) ，その制御様式及び機序についてはまだ議論の最中である。また血管系のうち，毛細血管や微小血管の血管壁外周にはペリサイト（周皮細胞）と呼ばれる細胞が存在し，アストロサイトと密接な解剖学的位置関係を呈しているが，その生理的役割についてはまだ不明な点が多い。そこで私達は，このアストロサイト−ペリサイト−血管系連関に注目し，アストロサイト−ペリサイト間での ATP/P2 受容体を介したコミュニケーションおよびペリサイトでの ATP/P2 受容体を介したシグナルの生理学的な役割について検討を行った。ラット海馬初代培養アストロサイトは，機械刺激により周囲のアストロサイトに伝播する Ca2+ wave を呈するが，これはATP 及びP2Y1 受容体依存的であった。また，ラット脳初代培養ペリサイトを用いた薬理学的な検討から，ペリサイトでは主に P2Y2 受容体が発現しており，Ca2+ wave等の機能とリンクしていることが明らかとなった。そこでアストロサイト−ペリサイト共培養系を作製し，単一のアストロサイトに機械刺激を与えたところ，近傍アストロサイトだけでなくペリサイトへも，P2 受容体を介した Ca2+ wave が伝播した。ペリサイトはa-smooth muscle actin を発現することが知られている。そこでペリサイトを ATP 及びP2Y2受容体作用薬UTPで灌流刺激すると，細胞内 Ca2+ 濃度の上昇に続いて細胞の収縮が観察された。また，このペリサイトの収縮反応はUTP 濃度依存的であり，suramin によって有意に抑制されたことから P2Y2 受容体を介した応答であることが示唆された。以上，アストロサイトはgliotransmitter ATPにより，シナプス伝達の制御だけでなく，ペリサイトの収縮・弛緩応答にも関与していることが明らかとなった。これらATP を介したアストロサイト−ペリサイト連関は，局所脳血流の制御と密接に関連している可能性が示唆された。
山下勝幸（奈良医大・第一生理）
中枢神経系は神経管を構成する神経上皮から発生する。神経上皮細胞の増殖にATP受容体の活性化と細胞内Ca動員が必要であることを，発生初期鶏胚の網膜神経上皮を用いた研究から報告した。さらに，細胞周期のうちS期細胞の核内Ca濃度がATP受容体の活性化により上昇することを明らかにした1。この研究において，小胞体 (ER) と核膜を，ERの蛍光プローブであるDiOC5 (3)でラベルしたところ，その蛍光強度が自発的にオシレートすることを発見した。DiOC5 (3)は電位感受性色素であり，Caオシレーションが起こることは既に観察していたので，DiOC5(3)の蛍光オシレーションは，Caストアの膜電位変化を示すと考えられた。そこで，Caストアの膜電位変化機構の解明とCaストアに存在するイオンチャネルの同定を行なった。
まず，DiOC5 (3)の膜電位感受性を，DiOC5 (3)でラベルしたパッチ膜を電位固定することにより決定した。その結果，1 mV の電位変化に対し，1.3 %の蛍光強度変化を示した。また，DiOC5 (3)でERと核膜をラベルしATPを投与すると，DiOC5 (3) 蛍光は二相性の強度変化を示した。この変化は，Ca放出によりCaストアの膜電位が負方向へ変化し，続いて，ストアのCaポンプによるCa uptakeにより正方向へ変化したことを示唆する。核膜からのパッチ記録と抗体ラベルから，BKチャネルがCaストアに存在することが示唆された。このチャネルはストア内の正方向への電位変化，および，ストア内Ca濃度上昇により活性化された。これらの結果から，Caストアに存在するBKチャネルの活動によって，Caストアの膜電位が脱分極と過分極の二つの状態をとることが示唆された。事実，Caストアの膜電位は振幅が45 mVにおよぶ双安定性のオシレーションを示した2。Caストアの膜電位変化はCa放出を制御し，Caオシレーションの発生，および，その細胞間同期を担うメカニズムとして考えうる3。
1. Sugioka M, Yamashita M (2003) Calcium signaling to nucleus via store-operated system during cell cycle in retinal neuroepithelium. Neurosci Res 45:447-458.
2. Yamashita M, Sugioka M, Ogawa Y (2006) Voltage- and Ca2+-activated potassium channels in Ca2+ store control Ca2+ release. FEBS J 273:3585-3597.
3. Yamashita M (2006) ‘Quantal’ Ca2+ release reassessed —a clue to oscillation and synchronization. FEBS Lett (published online).
輿水崇鏡1，上野晋2，柳原延章2，辻本豪三1
（1京都大学薬学研究科ゲノム創薬科学分野，2産業医科大学医学部薬理学講座）
P2X受容体チャネルのスプライシングによる機能変化が，サブユニット間の相互作用に及ぼす影響については未だ詳細な検討がなされていない。今回我々はマウス下垂体に発現する新たなバリアントサブユニットP2X2eの機能とサブユニット間相互作用について解析した結果を報告する。P2X2eはカルボキシル基 (C) 末細胞内部分の一部に相当する塩基配列が，スプライシングによりin-flameで欠失し，これまで知られている全長のP2X2aやC末スプライシングバリアントであるP2X2bよりもさらに短くなっていることが判明した。C末のスプライシング反応はP2X2遺伝子の最終エクソン内に存在するcryptic splicing siteが利用され，マウスP2X2遺伝子の5'上流には下垂体成長ホルモン産生細胞株で特異的に活性化されるエンハンサー領域が存在した。動物細胞あるいはアフリカツメガエル卵母細胞に強制発現させた場合，P2X2eサブユニットは単独で陽イオンチャネルを形成し，ATPのpotencyはP2X2aと同程度を示した。P2X2eの機能面では，ATPの継続する或は反復する刺激に対し野生型のP2X2aやスプライシングバリアントのP2X2bよりもはるかに早い脱感作を起こす特徴を持っていた。よってP2X2eのC末構造は，2回膜貫通領域を持つATP受容体の脱感作に重要な受容体部分を同定する手掛かりとなる有用な知見であった。下垂体前葉細胞にはP2X2aとP2X2bをコードするRNAがほぼ等量共存し，P2X2eの発現量はこれらの約半分程度であった。P2X2aがP2X2bやP2X2eと同一細胞に共存した場合ヘテロマーを形成した。よってP2X2aによる持続的細胞内カルシウム濃度の上昇がヘテロマーを形成することで制限されることが示唆された。
受容体C-末の異なるスプライシング様式がサブユニット間相互作用に及ぼす影響について，生きたままの細胞を用いて調べることを目的に，P2X2a，P2X2b，P2X2eのC-末あるいはアミノ基末にGFP蛍光蛋白質とLuciferase発光蛋白質を付加した融合蛋白質を共発現させ，光振動エネルギー移動現象 (biological resonance energy transfer, BRET) の有無を観察した。発光／蛍光蛋白質を融合後もP2Xサブユニットの細胞膜への局在，ATP感受性，脱感作様式，生化学的なサブユニット間相互作用には影響が見られなかった。共発現細胞においてC-末同士あるいはC-末とアミノ基末においてBRETが惹起されP2X2サブユニット間の相互作用を解析することに成功した。興味深いことにP2X2受容体のC-末はスプライシングを受けて短くなる程相互作用が強くなることが判明した。更に，C-末が短くなる程，アミノ末端との相互作用も強くなった。これら細胞内におけるサブユニット間の相互作用はATPの刺激では変化せず，この相互作用は構成的であると考えられた。
以上，新たに同定されたP2X2eサブユニットを用いた解析により，P2X2受容体の脱感作機構，及びサブユニット細胞内部分における相互作用の理解に繋がる，重要な知見を得ることができたのでここに報告した。
［参考文献］
Koshimizu T, Kretschmannova K, He ML, Ueno S, Tanoue A, Yanagihara N, Stojilkovic SS, Tsujimoto G (2006) Carboxyl-terminal splicing enhances physical interactions between the cytoplasmic tails of purinergic P2X receptors. Mol Pharmacol 69:1588-1598.
小林 剛1，武田美江1，Fernando Lopez-Redondo2，古家喜四夫2，
山本希美子3，安藤譲二3，曽我部正博1,2
（1名古屋大・医・細胞生物物理，2JST・SORST・細胞力覚プロジェクト，
3東京大院・医・医用生体工学講座システム生理学）
血管内皮細胞は，細胞膜表面上に発現したP2X4受容体を介して血流の変化を感知することができる。その際に，血流のshear stress（せん断応力）の変化が細胞内へのカルシウムイオンの細胞内流入へ変換される。このような力学刺激応答におけるカルシウム動員は一つの細胞においても空間的に制御されており，細胞膜上の小器官であるカベオラが多く存在する部位で反応が見られることが報告されている。我々は，それらの力学応答の空間制御には，P2X4受容体のダイナミクスの空間的な調節が重要な役割を果たしているのではないかと考え，細胞膜上におけるP2X4受容体の動態の可視化解析を試みている。そのため，C末端にmonomeric GFPを融合したP2X4-mGFPを培養細胞に発現し，蛍光イメージングを行った。しかし，通常の落射蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡を用いて観察すると，細胞内小胞にGFPの強いシグナルが認められたが，細胞膜上には，その発現がほとんど見られなかった。これまで，P2X4受容体は細胞膜上に発現するが多くは細胞内小胞に存在することが報告されている。従って，細胞膜上には少数の受容体分子が存在し，それに由来する蛍光シグナルが，細胞内小胞に存在するP2X4-mGFP由来の蛍光の中に埋もれてしまい検出できていないと考えられた。そこで，我々は，細胞膜上の受容体分子を可視化するために，全反射蛍光顕微鏡による1分子イメージングを行った。励起用レーザ光を全反射させ滲み出したエバネッセント光により培養細胞の細胞膜近傍を選択的に励起すると，P2X4-mGFPを発現した細胞では，細胞内小胞由来の明るい蛍光強度の輝点のほかに，暗い輝点が観察された。暗い輝点は，その蛍光強度分布やその一段階消光から判断して，GFP 1分子レベルの信号であり，焦点平面を2次元的に拡散運動したことから，細胞膜上のP2X4-mGFPであると考えられた。これらのP2X4-mGFP分子のほとんどは速い拡散運動（拡散係数0.6 mm2/s at 32℃）を示した。P2X4受容体の細胞外部位を認識する蛍光標識プローブを用いて細胞膜上のP2X4受容体分子を特異的に検出しイメージングした場合でも，同様の運動が観察された。また，輝点の蛍光強度分布から，細胞膜上の受容体は報告されているように3量体で存在すると考えられた。カベオラのマーカーであるcaveolin-GFPとP2X4を細胞に共発現し同時観察したところ，細胞膜上のP2X4受容体分子とcaveolinとの共局在は認められなかった。これらの結果より，力学刺激応答時に観察される細胞内カルシウム動員の空間的な制御には，カベオラとP2X4受容体分子の安定的な相互作用には依存しないと考えられた。
渡辺恭良（理化学研究所分子イメージング研究プログラム，
大阪市立大学大学院医学研究科システム神経科学）
ポジトロンエミッショントモグラフィー (PET) 等による「分子イメージング」により，神経機能，グリア機能，そして，その統合による脳機能に関する機能分子や病態時の異常分子を追跡することができる。現在，文部科学省の分子イメージング研究プログラムがスタートし，その中で，神経・グリア分別機能分子イメージングや，GenotypeとPhenotypeとの橋渡し研究が行われる。理化学研究所フロンティア研究システム (FRS) 分子イメージング研究プログラムは，そのプログラムの中で，「創薬候補物質探索拠点」として拠点形成の任務を与えられ，様々な神経科学領域の共同研究についてもプロジェクト化を担っていく。
我々は，科学技術振興機構の国際共同研究（1993-1997年），日本学術振興会の未来開拓学術研究事業（1998-2003年），文部科学省学術創成研究（2001-2006年）のプロジェクトを中心にPETを用いた分子イメージング研究を行ってきた。PETにおいては，適切なポジトロン核種で標識した化合物を開発し，それらを超高感度分子プローブとして，生きて機能している状態での生化学的分子情報の動態追跡を行う。PETを用いて脳局所血流量を計測する脳賦活試験により，脳タスク依存的な配座（担当部位）や神経回路網の情報が得られる。また，その脳機能担当部位でどのような神経伝達物質やシグナル伝達分子が働いているかについては，PETを用いて神経伝達物質やその受容体をイメージング・定量解析することが必要である。脳発達障害，学習障害や慢性疲労を含む脳病態において重要視される様々な因子と細胞情報伝達，特異的物質代謝について，新規のイメージング法を開拓し，これらを用いた基礎・臨床研究により分子―機能の橋渡しをすることが主眼である。そして，病態時のそれぞれの変化を探ることによって，病態の分子動態的把握，治療候補薬剤の効果について検討する。このような方法論が“個”のポストゲノム研究・ゲノム創薬研究を進めるのに有力であることを十分意識し，同一個体の脳機能発達過程や老化・病的過程の脳内分子環境推移を解明することを目指して研究を進めている。ここでは，動物用マイクロPETを用いた研究の現状や我々が開発してきたBioradiographyなどの方法論についても紹介したい。
久下裕司（京都大学大学院薬学研究科・病態機能分析学分野）
虚血性脳血管障害は，最も頻発する脳神経系疾患のひとつであり，その罹患患者数は増加傾向にある。近年，この脳虚血病態において，神経細胞だけでなく，グリア（特にアストロサイト）細胞や，神経細胞−グリア細胞の相互作用が重要な役割を担っていることが明らかとなってきた。
一方，分子イメージング技術は，生体内における生命現象の分子プロセスを生きた状態で画像として表示することができる技術であり，生体機能の解明に役立つものとして注目されている。これらには，放射性同位元素 (RI) で標識したプローブを用いるRI分子イメージング法（ポジトロンCT，シングルフォトンCT），蛍光（発光）分子で標識したプローブを用いる光イメージング法などがあり，それぞれの特長を生かして種々の研究に用いられている。
我々は，RIが物質透過性と定量性に優れることから，小動物だけでなく，大動物やヒトにおいても定量的解析が可能なRI分子イメージング技術に着目し，分子イメージングによる脳虚血病態解析に関する研究を展開してきた。すなわち，① RI標識した中枢性ベンゾジアゼピン受容体リガンド(123/125I-iomazenil) を用いる神経機能評価，② RI標識したオクタン酸 (11/14C-octanoate) を用いるアストロサイトの機能評価，及び③神経・グリア機能とシクロオキシゲナーゼ-2 (COX-2) 発現の解析等を通して，神経・グリア機能とCOX-2発現が，虚血の程度と関連し，時間的・空間的にダイナミックに変化していることを示してきた。また，最近では，分子イメージングによるCOX-2発現の可視化を目指して，COX-2を標的とするRI標識プローブの開発に取り組んでいる。
本会では，我々の研究成果を中心に，分子イメージングによる脳虚血病態，特にニューロン・グリア機能解析に関する最近の知見を紹介する。
周東智（北海道大学薬学研究院・創薬有機化学研究室）
ゲノム創薬への社会的期待は極めて大きい。ヒトゲノム解読やバイオインフォマティクスの急速な進歩に伴い，創薬標的蛋白質の同定が効率化されつつあるが，新薬開発は必ずしも加速されていないのが現状である。この主な原因は，コンビナトリアルケミストリー・化合物ライブラリー・HTS (high throughput screening) 等の創薬テクノロジーを用いたランダムスクリーニングを基本とする昨今の新薬開発戦略が必ずしも効果的ではないこと，即ち，標的分子同定後の新薬に至る段階の効率的な方法論の欠如にある。従って，創薬標的分子に対して特異的に結合する低分子リガンド（アゴニストやアンタゴニスト）の合理的・効率的な創製を可能にする方法論の開発が急務であり，これが成されて初めて本質的なゲノム創薬は実現する。私達は，細胞膜受容体に対する特異的リガンドを論理的に創製する方法の開発に有機化学からアプローチしている。
標的分子に対する薬の親和性の強弱は，結合する際の自由エネルギー変化 (DG) に依存する。従って，標的との結合に好適な官能基が好適に三次元配置された低分子（薬）がエンタルピーとエントロピーの両面から有利となり，DGの大きな減少を伴い強力に標的と結合し，強い薬理活性が発現しうる。これを踏まえて，好適な官能基とその好適な三次元配置（配座）を合理的に見出すことが可能な“立体的多様性を鍵とする分子設計法”を考案した。この方法の特徴は，立体的に小さくかつ強固なシクロプロパンの構造特性を活用して，三次元的に多様な構造に官能基を制御した一連の配座制限型誘導体を設計・合成し，薬理活性を評価することにある。
本講演では，上記方法論により創製した中枢における神経伝達物質受容体リガンドであるAEIC及びPPDCについて紹介する。AEICは，中枢新薬の創薬標的に想定されているヒスタミンH3受容体に対する初めての高選択的アゴニストである。一方，PPDCはアルツハイマー病との関係で最近注目されているNMDA受容体に対する，従来にないタイプの特異的アンタゴニストである。
参考文献
1. Kazuta Y, Matsuda A, Shuto S. J Org Chem 67: 1669-1677 (2002).
2. Kazuta Y, Hirano K, Natsume K, Yamada S, Kimura R, Matsumoto S, Furuichi K, Matsuda A, Shuto S. J Med Chem 46: 1980-1988 (2003).
3. 周東智，松田彰，創薬：オングストロームの分子設計。“ナノバイオエンジニアリング，化学フロンティア13”，杉本直己偏，2004, pp37-49.
4. Watanabe M, Kazuta Y, Hayashi H, Yamada S, Matsuda A, Shuto S. J Med Chem (in press).
永井健治（北海道大学・電子科学研究所・ナノシステム生理学研究分野
特定の外界刺激に応じて，細胞内では特定のシグナル伝達反応が起こり，細胞の分化，形態変化，分裂，死などの現象が誘起される。こうした細胞内の情報伝達に関わる分子群とそれらの相互作用に関する知見は我々の頭では記憶できないほど蓄積している。しかし，これらの知見からは“生体システムに潜む原理”を理解することは難しい。これはちょうどコンピュータ回路図を手にし，それに従ってコンピュータを作ることができても，コンピュータが何故作動するのかを理解できないのと同じである。“生体システムに潜む原理”を理解するためには，生体情報がどのように動き回っているのかを“見る”技術と生体分子を“操作”する技術が必要である。本研究会では特に，蛍光タンパク質や化学発光タンパク質の共鳴エネルギー移動を利用した機能指示薬の開発とそれを用いたリアルタイム機能イメージングについての我々の知見を紹介し，個体レベルでのニューロン・グリア機能解析に迫るための今後の展望を述べたい。
高田則雄，平瀬肇
（理化学研究所脳科学総合研究センター）
大脳皮質において最も数の多いグリア細胞はアストロサイトである。アストロサイトには神経細胞と相互作用するためのさまざまな機構がある。例えば，アストロサイトは神経情報伝達物質の受容体（AMPA受容体，P2X受容体，mGlu受容体など）を持ち，また自ら情報伝達物質（Glu，GABA，ATP，D-serinなど）を放出することが知られている。これらの受容体の活性化あるいは情報伝達物質放出の際にはアストロサイトの細胞内カルシウム濃度が上昇する。そのため細胞内カルシウム応答はアストロサイト活動の指標と考えられている。
アストロサイトのカルシウム応答のパターンには一過的上昇，持続的上昇，周期的振動が知られており，アストロサイトへの刺激特性に依存してパターンが変化すると考えられている。また，アストロサイトをGluで繰り返し刺激することで，周期的振動パターンを示すカルシウム応答の周波数が長時間上昇する（長期増強）ことが報告されている(Pasti et al., 1995)。さらに，単一のアストロサイトに生じた細胞内カルシウム上昇は近隣のアストロサイトに伝播することが示されている(Nedergaard, 1994)。これらの事実からアストロサイトはこれまで想定されていなかった脳神経情報処理も担うのではないかと予想されている。
上記の知見はin vitroの系を用いた実験で得られたものである。アストロサイトの形態や受容体の発現状態は細胞外の環境によって大きく変化することが知られている。in vitroの系では脳血流や神経細胞の自発的活動が失われているため，in vitroの研究で示唆されたアストロサイトの機能が実際の脳内でも生じる現象かどうかは不明である。そこで我々は麻酔下ラットの大脳皮質を2光子顕微鏡観察することで，in vivoにおけるアストロサイトの自発的カルシウム動態を解析した。アストロサイトの細胞内カルシウム濃度の計測には緑色のカルシウム感受性蛍光色素 (Oregon Green BAPTA-1，Fluo-4) を用いた。神経細胞とアストロサイトを区別するために，アストロサイトを特異的に染色する赤色の蛍光色素(Sulforhodamine-101) を用いた。その結果，幼弱ラットと成熟ラットではアストロサイトの自発的カルシウム上昇の頻度が異なることが判明した。また大脳皮質の層ごとにアストロサイトの活動状態が異なることを見つけた。カルシウム上昇の持続時間や時空間的な同期性について現在解析中である。
参考文献
Nedergaard M (1994) Direct signaling from astrocytes to neurons in cultures of mammalian brain cells. Science 263: 1768-1771.
Pasti L, Pozzan T, Carmignoto G (1995) Long-lasting changes of calcium oscillations in astrocytes. A new form of glutamate-mediated plasticity. J Biol Chem 270:15203- 15210.
南雅文
（北海道大学大学院薬学研究院 薬理学研究室）
ミクログリアは，通常，脳内で多数の細長い突起を有するラミファイド型と呼ばれる形態をとり，周囲の細胞と接触し脳内環境を監視しているが，脳組織が傷害されると周囲からの様々な因子に反応して突起を退縮させた活性化状態のアメボイド型へとその形態を変化させる。本研究では，脳組織に傷害を与えたときに生じるミクログリアの形態変化について，その調節機構を明らかにすることを目的として脳スライス培養を用いた検討を行った。
培養海馬スライスにレーザーを用いて傷害を与えると，傷害直後にミクログリアは急速に傷害部位に向かって突起を伸長させ，この突起伸長は30分程度で収束した。一方，傷害部位の反対側においては突起の退縮が観察された。
細胞の傷害によって細胞外へと漏出したATPが，ミクログリアの傷害部位への突起伸長を惹起する可能性が考えられた。そこで，ATPの受容体であるP2プリン受容体の阻害薬であるReactive Blue 2 (RB2) およびATP分解酵素であるapyraseの効果を検討したところ，これらの薬物はいずれもミクログリアの傷害部位への突起伸長を有意に抑制した。
ミクログリア突起伸長を調節する細胞内シグナル伝達を明らかにする目的で，先ず，cAMPのアナログであるdbcAMP (10-100 mM)の処置を行ったところ，濃度依存的に突起伸長を抑制することが明らかとなり，cAMP-Aキナーゼ系がミクログリア突起伸張を抑制的に調節している可能性が示唆された。
傷害部位へのミクログリア突起伸長はインビボにおいても観察されることが最近報告されたが，インビボではその分子機構の解析が難しいと考えられるのに対して，本実験系では各種阻害薬や中和抗体を用いた解析を容易に行うことができるという利点を有しており，脳組織傷害時におけるミクログリアの形態変化・細胞移動制御の分子機構を研究する上で有用であると考えられる。
【謝辞】
Iba1-EGFPトランスジェニックマウスを御供与下さいました国立精神・神経センター神経研究所高坂新一先生，および研究方法に関して多くの御指導・御助言を賜りました京都大学医学研究科先端領域融合医学研究機構木村宏先生に深謝いたします。
森岡徳光，Md Joynal Abdin，北山友也，森田克也，土肥敏博
（広島大学大学院医歯薬学総合研究科）
グルタミン酸は中枢神経系における主要な神経伝達物質であるが，過剰なグルタミン酸は神経細胞障害を引き起こすことが知られている。それ故，シナプス間隙におけるグルタミン酸濃度制御は様々な神経疾患に関与する重要なファクターである。グルタミン酸トランスポーター(EAAT) は，細胞外グルタミン酸濃度の調節を担う最も重要な機能分子であり，その機能異常は様々な病変に関与していることが報告されている。従来，アストロサイトに発現するEAATが専ら細胞外グルタミン酸濃度制御に深く関与すると考えられてきたが，近年ミクログリアにおいてもEAATが発現し，様々な病態時において機能変化が生じていることが報告されつつある。しかしながら，ミクログリアにおけるEAAT機能制御機構についての詳細は未だ明らかではない。そこで本研究では脊髄由来初代培養ミクログリアを用いて制御候補因子としてATPの役割に注目し，脊髄ミクログリアにおけるEAAT機能に対する影響を検討した。培養脊髄ミクログリアにおいてはグリア型EAATであるGLAST及びGLT-1が発現していることが確認された。さらにATP及びP2X7選択的作動薬BzATPを前処置することにより，細胞外Ca2+及びNa+非依存的にグルタミン酸取り込み能は有意に減少した。BzATPによるグルタミン酸取り込み抑制作用は，P2X7選択的拮抗薬brilliant blue G及びATP peiodate oxidized前処置によりほぼ完全に消失した。さらにMEK/ERK阻害剤であるU0126及び抗酸化剤であるN-acetyl-L-cysteine前処置によってもBzATPによるグルタミン酸取り込み抑制作用は部分的に消失し，両者の併用によりほぼ完全に消失した。またBzATPはグルタミン酸取り込み能に対してVmaxを著明に低下させたが，Kmは無影響であった。以上の結果から，脊髄ミクログリアにおけるP2X7はERK活性化及び酸化ストレス増大を介してグルタミン酸輸送能を制御し，脊髄内におけるグルタミン酸ホメオスタシスに関与している可能性が示唆された。
中川貴之1，若松佳代1，前田早苗1，南雅文2，佐藤公道3，金子周司1
（1京都大学薬学研究科生体機能解析学分野，2北海道大学薬学研究科薬理学分野，3安田女子大学）
ATPやP2X受容体アゴニストを脊髄くも膜下腔内 (i.t.) に投与すると，持続時間の短い痛覚過敏（＜数分）や，アロディニアが惹起されることが知られているが，我々は，このアロディニアの持続時間が，末梢投与した場合のアロディニア（＜約2時間）と比較して，非常に長期間にわたって持続（3〜4週間）するものであることを見出した。この脊髄内ATP誘発長期持続性アロディニアは，新生児期カプサイシン処置によっても影響を受けず，P2X2/3受容体選択的拮抗薬あるいはNMDA受容体拮抗薬MK-801の同時処置により消失したことから，カプサイシン非感受性一次感覚神経中枢端に存在するP2X2/3受容体の活性化がトリガーとなり，グルタミン酸遊離−NMDA受容体活性化を介して誘導されると考えられた。しかしながら，P2X2/3受容体拮抗薬は，ATP投与翌日の形成されたアロディニア（維持初期）に対しては僅かに抑制作用を示したものの，ATP投与7日後のアロディニア（維持後期）に対しては影響を与えず，またMK-801はいずれの時間においても影響を与えなかった。次に，脊髄内ミクログリアおよびアストロサイトをそれぞれのマーカーであるOX-42およびGFAPで免疫染色したところ，ミクログリアはATP投与数時間〜1日後，アストロサイトは1〜3日後にかけて，それぞれ活性化を示す変化を示した。また，ミクログリア阻害薬ミノサイクリンおよびグリア細胞代謝阻害薬フルオロシトレートの効果を検討したところ，ミノサイクリンは誘導期（同時投与）において，フルオロシトレートは誘導期〜維持初期（ATP投与1日後）において抑制作用を示したが，維持後期（ATP投与7日後）においてはどちらも影響を与えなかった。次に，脊髄内ERKのリン酸化を検討したところ，ATP投与1-8時間後に顕著なERKリン酸化の亢進が認められ，維持初期においても高いレベルを持続していた。MEK阻害剤U-0126の投与により，長期持続性アロディニアは誘導期〜維持初期において有意に抑制されたが，維持後期において影響は見られなかった。これらの結果から，ATPのi.t.投与によって惹起される長期持続性アロディニアは，誘導期〜維持期初期にかけては，脊髄内のミクログリアおよびアストロサイトが，おそらくERKのリン酸化を介して，時間経過とともに役割を変えながら関与すると考えられる。
津田誠，井上和秀（九州大学大学院薬学研究院薬効解析学分野）
最近，末梢神経損傷により発症する神経因性疼痛に脊髄後角でのグリア細胞の役割が注目されている。以前我々は，神経因性疼痛動物モデルの脊髄後角において，ATP受容体サブタイプであるP2X4受容体の発現がミクログリアで著明に増加し，同受容体を遮断することでアロディニアが抑制されることを報告した。すなわち，神経因性疼痛発症にミクログリアにおけるP2X4受容体の発現増加が重要なステップであることを示した。そこで今回は，ミクログリアにおけるP2X4発現調節に関わる細胞内情報伝達機構について報告する。
初代培養ミクログリア細胞は，P2X4受容体の発現を増加させるフィブロネクチンで処置し，前回の報告と一致して，P2X4受容体タンパク質レベルの増加が認められた。その増加は，Srcファミリーキナーゼ (SFK) 阻害剤PP2およびMEK阻害剤U0126で著明に抑制された。さらに，MEKの下流分子であるERKは，フィブロネクチンによりリン酸化され，活性化状態になり，その活性化はPP2で抑制された。さらに，フィブロネクチンは，転写因子CREBをリン酸化し，ミクログリア核内レベルを顕著に増加した。このCREBのリン酸化はPP2およびU0126で抑制された。以上の結果は，P2X4受容体の発現はSFK/MEK/ERK経路が関与していることを明らかにしている。また，核内における転写因子CREBの活性化がP2X4受容体の転写調節に何らかの役割を有している可能性が予想される。
中塚映政，古賀秀剛，青山貴博，藤田亜美，熊本栄一
（佐賀大学医学部生体構造機能学講座神経生理学分野）
頚髄症・椎間板ヘルニア・変形性脊椎症など日常遭遇する疾患から，後縦靭帯骨化症・脊髄腫瘍など稀な疾患までを含めると広義の脊髄損傷を呈するものは数多い。特に，外傷性脊髄損傷によって急激に四肢や体幹の麻痺を呈し，ADLは著しく低下する。脊髄損傷による麻痺の主原因は直接外力による脊髄神経細胞の損傷であるが，遅発性に麻痺は急激に拡大する。直接外力による不可逆的な脊髄神経細胞損傷は治療困難であるが，急性期における遅発性脊髄障害への対策は非常に重要であり，長らく副腎皮質ステロイドホルモンの大量療法が施行されてきた。しかしながら，副腎皮質ステロイドホルモン大量療法の有効性は乏しいだけでなく副作用も多く，新しい作用機序を有する治療薬の登場が待ち望まれている。近年，Nature Medicine誌に脊髄損傷の急性期治療としてP2X7受容体阻害薬が有効であると報告されて，脊髄損傷におけるATP受容体の関与が指摘された。しかしながら，脊髄前角細胞におけるATP受容体の機能的役割はほとんど知られていない。
今回，ラット脊髄横断スライス標本にホールセルパッチクランプ法を適用し，脊髄前角細胞におけるATP受容体の役割を検討した。電位固定法を用いて保持膜電位を-70 mVに固定して，代謝安定型のATP受容体広作動域作動薬であるATPgS (100 mM) を灌流投与すると，約40％の脊髄前角細胞において内向き電流が観察された。また，ATPgS (100 mM)によって内向き電流が観察される細胞にP2X受容体作動薬であるa,b-methylene ATP (100 mM) ならびにBzATP (100 mM) を灌流投与したが内向き電流は観察されなかった。同様に，P2Y受容体作動薬であるUTP (100 mM) ならびにUDP (100 mM) の灌流投与により内向き電流は観察されなかったが，2-methylthio ADP (100 mM) を灌流投与するとATPgS (100 mM) と同様に内向き電流が観察された。さらに，ATPgS灌流投与によって生じた内向き電流は，P2Y1受容体拮抗薬であるMRS2179 (30 mM) の存在下において完全に阻害された。
以上の結果から，約半数の脊髄前角のシナプス後細胞においてP2Y1受容体が発現しており，脊髄損傷によって遊離されるであろう細胞外ATPによって脊髄前角細胞はP2Y1受容体を介して脱分極することが明らかとなった。したがって，脊髄損傷の急性期における遅発性神経障害にP2Y1受容体が深く関与している可能性が示唆された。
加藤総夫（東京慈恵会医科大学・総合医科学研究センター・神経生理学研究室）
中枢神経系におけるシナプス伝達の多くが，シナプス周囲プリン受容体の活性化によって修飾される。特に，アデノシンA1受容体とP2X受容体チャネルは，多くの興奮性シナプスにおいてシナプス前に局在し，それぞれ電位依存性カルシウムチャネルの修飾と直接的カルシウム流入によって神経伝達物質放出を制御する。これらの機構が，グリオトランスミッターATPとその細胞外変換体アデノシンを介したアストロサイトによるシナプス伝達の修飾におけるインターフェースとして機能している可能性を示す証拠が近年蓄積しつつある。これらシナプス前プリン受容体タンパクの発現制御機構は大部分未解明であり，特に，軸索終末・樹状突起構造とシナプス周囲グリア細胞突起との構造的連関が維持されたin vivoのシナプスにおけるシナプス前プリン受容体の発現とその機能の連関についてはまったく解析が行われていない。その最たる原因はin vivoのシナプスにおけるシナプス前タンパクの選択的かつ特異的発現制御を行いうる実験系が存在しないことにある。
この問題に答えうる実験系として，我々は，in vivo神経節gene silencing法を開発した。今回はシナプス前アデノシンA1受容体のノックダウンの影響を検討した結果を紹介する。本研究の背景となった実験的事実は以下の5つである。
1. 胸腹部の内臓感覚受容器から延髄孤束核に収斂する迷走神経求心路を介した内臓感覚情報の一次求心性線維の細胞体は，頚部の節状神経節に局在している。
2. これらの一次求心性線維は脳内に入り孤束核で2次ニューロンとシナプスを形成する。このシナプスはグルタミン酸を伝達物質とする興奮性シナプスである。
3. この興奮性シナプスにはシナプス前A1受容体が発現し，その活性化はN型電位依存性カルシウムチャネルの抑制を介して刺激誘発シナプス伝達を抑制する。
4. 孤束核シナプス前A1受容体は節状神経節で合成され，迷走神経求心路を経て輸送される。
5. 培養節状神経節細胞において，RNA干渉法がアデノシンA1受容体の発現を効果的に抑制する。
以上の知見に基き，我々は，麻酔ラットの頚部節状神経節を露出し，電気穿孔法によって合成short-interfering RNA (siRNA)，および，GFP発現非ウィルスベクターを導入し，それぞれ，一次求心性細胞における特定タンパクの発現抑制，および，外来タンパクの強制発現を可能にする系を確立した。アデノシンA1受容体siRNA導入は節状神経節mRNA発現を著明に減弱 (< 30%) させ，さらに，その11-13日後に作成した急性孤束核スライスにおいて，孤束一次求心路−2次ニューロン間興奮性シナプス伝達に対するアデノシンの抑制効果が減弱した。本法の意義と限界，および，シナプス前プリン・シグナルの機能的意義の解明に対する貢献の可能性について論じたい（研究協力者：繁冨英治，山田千晶，田村友穏）。
金田誠，石井俊行＊，重松康秀＊＊，細谷俊彦＊，霜田幸雄＊＊
（慶應大・医・生理，＊理研・脳センター・細谷研究ユニット，＊＊東京女子医大・総研）
マウス網膜コリン作動性アマクリン細胞にはON型とOFF型の二種類が存在する。われわれは免疫組織化学的検討とパッチクランプ法を用いた電気生理学的検討から，マウス網膜ではP2X2受容体がOFF型コリン作動性アマクリン細胞に選択的に発現していること，ATPを投与するとOFF型コリン作動性アマクリン細胞のP2X2受容体が活性化され陽イオン電流が流れることを過去に報告してきた。P2X2型はOFF経路特異的に存在することから，マウス網膜ではON経路とOFF経路でATPを介した応答制御機構が異なっていることが考えられる。そこでマウス網膜ホールマウント標本からマルチ電極法を用いて網膜神経節細胞の光応答を記録し，光刺激で生じる網膜神経節細胞の光応答がどのようなP2X受容体の制御を受けているのかについて検討を行った。
今回の実験では，光刺激で発火頻度が上昇するON型と，光刺激を中止すると発火頻度が上昇するOFF型の二種類の網膜神経節細胞が記録された。ON-OFF型の細胞は記録されなかった。光刺激に対して安定した応答を示す網膜にPPADSを投与してP2X型プリン受容体を介する応答を遮断すると，OFF型では光刺激に対する発火頻度の上昇が見られたが，ON型では発火頻度は変わらないか減少した。OFF型で見られる発火頻度の上昇を詳しく検討するため，光刺激一周期の間に観察される活動電位発火数の総数を100%とし，刺激の開始（ON型は光刺激開始時，OFF型は光刺激中止時）からの発火頻度の総数の積算が85%を越える時間 (T85) を計測した。その結果OFF型ではPPADS投与時のT85の値が著明に増大していた。一方ON型ではT85の値に変化が認められなかった。
以上の結果からマウス網膜ではP2X受容体を介するOFF経路特異的な修飾機構が存在するものと考えられる。またわれわれのこれまでの研究結果から，OFF経路特異的な修飾機構にはP2X2受容体を介する経路が関係しているものと考えられた。
Mitsuo Satoh, Kazuya Yamano, Miho Inoue, Shigehiro Masaki, Mayumi Saki, Michio Ichimura
(Pharmaceutical Research Center, Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)
Although selective antagonists for the adenosine A3 receptor (A3AR), a member of the Gi/o protein-coupled receptors, have been indicated as potential drugs for anti-asthma or anti-inflammation, the in vivo evaluation of the antagonists using rodents in the first step of drug development has been hampered by the lack of highly potent antagonists for the rodent A3AR. To evaluate the pharmacological effects of human A3AR antagonists in mice, we generated mice by replacing the mouse A3AR gene with its human counterpart. The human A3AR normally led to the mobilization of intracellular Ca2+ in mice. However, unexpectedly, the human A3AR did not lead to the phosphoinositide 3-kinase (PI3K) g-signaling pathway in mice, probably due to the uncoupling of mouse Gi/o protein(s). To overcome the uncoupling, we next generated A3AR chimeric mice by replacing the mouse A3AR gene with a human/mouse chimeric A3AR sequence in which whole intracellular regions of the human A3AR were substituted for the corresponding regions of the mouse A3AR. The chimeric A3AR led to the intracellular Ca2+ elevation and activation of the PI3Kg-signaling pathway in mice, which are equivalent to the actions induced by the A3AR in wild-type mice. The human A3AR antagonist had the same binding affinities for the chimeric A3AR as the human A3AR and completely antagonized the potentiation. This is the first direct evidence that the uncoupling of member(s) of the mouse G proteins to the human A3AR is due to a sequence difference in the intracellular regions of A3AR and our results demonstrate that the A3AR chimeric mice can be widely employed as A3AR functionally humanized mice, which is the first rodent model for pharmacological evaluations of the human A3AR antagonists.
原田均，月本光俊，前畑真知子，五十里彰，高木邦明，出川雅邦
（静岡県立大・薬）
【目的】P2X7受容体は，ATPとの結合により活性化すると陽イオンの流入，分子量300 程度までの分子を通す小孔の形成，サイトカインの放出，細胞死などを引き起こす1。我々は，これらに加えて細胞外のCl- に依存した細胞径の縮小（細胞縮小）が誘導されることを報告している2。一方，マウス胸腺細胞においてP2X7受容体を介するErk1/2の活性化がネクローシスの誘導に関与するという報告もある3。本研究では，マウスT細胞の分化・成熟によるP2X7受容体活性の変動について検討した4。
【方法】4-6週齡雄性BALB/cマウスの胸腺および脾臓から分離した細胞を用いて実験を行った。P2X7受容体蛋白質の発現は特異的抗体を用いたウエスタンブロット解析により，細胞障害性は細胞外に漏出した乳酸脱水素酵素の活性を測定することにより調べた。細胞径の変化はフローサイトメーターを用いて前方散乱光を測定することにより解析した。
【結果および考察】P2X7受容体蛋白質の発現量は胸腺細胞に比べて脾臓細胞に多く，ATP処置による小孔の形成および細胞死の誘導も脾臓細胞においてより強く検出された。細胞径の変化について観たところ，胸腺細胞中約8割を占める未分化なCD4+8+胸腺細胞はATPにほとんど反応せず，CD4-8+胸腺細胞 < CD4+8−胸腺細胞 < CD8+脾臓細胞 < CD4+脾臓細胞の順に強い細胞縮小の誘導が認められた。B細胞には細胞縮小が誘導されなかった。これらのことは，分化・成熟したT細胞において細胞縮小活性が強いことを示す。ATP処置により誘導される細胞縮小化は，細胞外液中の塩素イオン濃度を低下させることにより抑制されたが，Erk1/2リン酸化阻害薬U0126の前処置によっては影響されなかった。一方，Erk1/2のリン酸化は細胞外液中の塩素イオン濃度に影響されなかった。ATP処置による細胞死の誘導は細胞外液中の塩素イオン濃度の低下およびU0126前処置によりそれぞれ抑制されたことから，P2X7受容体活性化による細胞死の誘導は独立した二つの経路を介して誘導されることが示唆された。
本研究結果から，分化・成熟したT細胞において，ATPに高感度に応答して細胞死が誘導されることが明らかとなった。今後，末梢でのT細胞の機能制御におけるP2X7受容体の役割を調べることが重要と考えられる。
［参考文献］
1．Virginio C, MacKenzie A, North RA, Surprenant A (1999) J Physiol 519:335-346.
2．Tsukimoto M, Harada H, Ikari A, Takagi K (2005) J Biol Chem 280:2653-2658.
3．Auger R, Motta I, Benihoud K, Ojcius DM, Kanellopoulos JM (2005) J Biol Chem 280:28142- 28151.
4．Tsukimoto M, Maehata M, Harada H, Ikari A, Takagi K, Degawa M (2006) J Immunol 177:2842-2850.
尾松万里子，藤居祐介，松浦博
（滋賀医科大学・生理学講座・細胞機能生理学部門）
細胞膜リン脂質の一員であるホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸 (PIP2) は，ホスホリパーゼC (PLC) 連関型受容体刺激によって活性化されるPLCによって分解され，セカンドメッセンジャーであるホスファチジルイノシトール-三リン酸 (IP3) 及びジアシルグリセロール(DAG) を生成する。PIP2の分布や分解の動態はPIP2に対して高い親和性を持つプレクストリンホモロジー(PH) ドメインと融合させた蛍光タンパクGFPを培養細胞に発現させることによって観察されてきたが，トランスフェクションの成功しにくい単離細胞において観察することは困難であった。
今回，我々はPIP2およびIP3の両方を認識する抗PIP2抗体を用いた免疫染色により，受容体刺激によって引き起こされる細胞膜PIP2の減少を測定する方法を確立した。PIP2は膜脂質の一部であるため，通常の免疫染色法を改良し，細胞膜内側に分布するPIP2の蛍光画像を得た。細胞膜PIP2の減少は，細胞内蛍光シグナルに対する細胞膜の蛍光シグナルの比を用い定量した。この方法を用いて褐色脂肪細胞をATPで刺激して細胞膜PIP2の変化を測定したところ，細胞膜における減少のピークはATPでは刺激後10秒であり，その後は徐々に再合成され，2分後には刺激前と同レベルまで回復することがわかった。この現象は細胞をUTPで刺激した時にも見られ，P2Y受容体刺激によるPIP2の減少と再合成の過程を観察していると考えられた。別のGq/PLC連関型受容体であるa 受容体をノルアドレナリンで刺激しても同様の結果が得られた。
これらのことから，抗PIP2抗体を用いた免疫染色によって得られる情報について検討する。
井村泰子，和光未加，加藤総夫
（慈恵医大・神経生理）
ATPがアストロサイトから放出される'gliotransmitter'である証拠が近年数多く提示されている。内臓感覚情報を受容・統合する延髄孤束核においてシナプス前P2X受容体チャネルの活性化は，終末内へのカルシウム流入を介してグルタミン酸放出を促進する(Kato & Shigetomi, 2001; Shigetomi & Kato, 2004)。このシナプス前P2X受容体の生理的機能を解明するために以下の2つの実験を行った。
【実験1】若齢Wistar系rat孤束核におけるglial fibrillary acidic protein (GFAP)およびneuronal nuclei (NeuN) の発現を免疫組織染色法により観察するとともに，シナプス周囲構造の電子顕微鏡観察を行った。その結果，孤束核においてもNeuN陽性ニューロンの周囲をGFAP陽性アストロサイト突起が取り囲み，また，非対称シナプスの多くがアストロサイト様構造に囲まれている事実が判明した。
【実験2】実験1の結果は，シナプス周囲のアストロサイトが放出するATPがシナプス前P2X受容体活性化を介したグルタミン酸放出を促進する可能性を示しているが，これを検証するためには，極短時間かつシナプス近傍限局的な細胞外ATP濃度上昇によって十分かつ即時的な伝達物質放出が誘発される可能性を検証する必要がある。この問題に答えるために，時間空間限局的投与が可能なlaser photolysis法を用い，シナプス近傍へのATP局所投与の影響を観察した。
同週齢ratの脳幹から作成した孤束核を含む厚さ400 mmの冠状断スライス標本を用い，近赤外線顕微鏡観察下に孤束核小型ニューロンを同定後，ホールセル法により活動電位非依存的シナプス後電流 (mEPSC) を記録した。蛍光物質の細胞内潅流によって樹状突起を視認し，突起上またはその近傍にlaser光束（3 mm径）の標的を設定した。DMNPE-caged ATPを細胞外微小圧投与し，laser照射および細胞外潅流の時間をFlash-and-Flush法により制御して，時間限局的に細胞外ATP濃度を上昇させ，シナプス入力の変化を記録した。
Laser照射直後（数100 ms）からmEPSC頻度の著明な増加が観察された。この増加はcaged ATPの非存在下には観察されず，PPADSによって抑制された。また，この増加が，細胞外ATP濃度の急速な低下にともなって速やかに消退する細胞と，数秒〜10数秒にわたり残存する細胞が認められた。さらに，短時間 (100-500 ms) ATP投与によるmEPSC頻度増加応答には樹状突起上の部位依存性 (< 5 mm) を示すものがあった。
以上の結果，アストロサイトから極近傍シナプスへの時間空間的に限局したATP放出は数100 ms・数mmレベルの時空範囲においてシナプス前P2X受容体を活性化することが可能であることが示唆された。
繁冨英治1,2，山田千晶1，加藤総夫1
（1東京慈恵医大・総合医科学研究センター・神経生理，2日本学術振興会特別研究員）
感覚神経節において，プリン受容体および細胞外プリン代謝酵素を含む細胞外プリンシグナリング関連機能分子が多数同定されている。細胞外プリンシグナリングは感覚神経節神経細胞→2次ニューロン間のシナプス伝達制御に重要な役割を演じているが，各分子の機能を選択的に抑制する方法論が存在しないことが原因で，これらの分子の機能的意義は未解明である。
頚部に位置する節状神経節からの1次求心線維は，延髄孤束核に投射し，孤束核2次ニューロンとグルタミン酸作動性シナプス（以下，孤束核シナプス）を形成する。このシナプス前終末で働くタンパクのmRNAは節状神経節で合成される。節状神経節においてin vivo遺伝子ノックダウンを行い，脳スライスを用いた孤束核シナプス伝達解析によって，分子の機能解析をする実験系の確立を目的とした。
節状神経節において，アデノシンA1受容体のmRNA (Middlekauff et al., 1998) およびタンパク(Krstew et al., 1998) の発現が報告されている。孤束核シナプスにおいて，シナプス前A1受容体の活性化はシナプス前抑制を示す(Kato & Shigetomi, 2001; Tsuji & Kato, 2003)。節状神経節においてA1受容体のin vivo遺伝子ノックダウンを行い，シナプス伝達調節に及ぼす影響を検討した。
麻酔下，Wistar系ラット（19-24日齢）の右節状神経節にエレクトロポレーション法を用いてA1受容体に対する合成siRNA（A1受容体siRNA），ランダムsiRNAおよびPBSを導入した。A1受容体siRNA導入後3-14日において，節状神経節におけるA1受容体のmRNAレベルは，無処置の神経節に対して30% 以下に減少した。孤束核シナプス伝達に及ぼす遺伝子ノックダウンの影響を評価するために，脳スライス標本を用いて，1次求心線維刺激誘発興奮性シナプス後電流 (eEPSC) を記録し，その振幅に及ぼすアデノシン (100 mM) の影響を検討した。siRNA導入9日後までは，アデノシンは，無処置群と同程度 (41.1±7.3%) かつ同様の時間経過でeEPSC振幅を抑制した。導入11日後，この抑制は17.8±3.8%まで有意に減弱した。siRNAによるアデノシンのeEPSC振幅抑制の減弱は導入後13日まで持続した。ランダムsiRNAおよびPBS導入はアデノシンによるeEPSC振幅抑制に影響しなかった。以上より，in vivo遺伝子ノックダウンによる節状神経節の遺伝子発現抑制により，孤束核シナプスのシナプス前A1受容体機能の減弱に成功した。この新しい技術は，感覚神経節神経細胞→2次ニューロン間のシナプスにおいて，シナプス前終末で働くプリンシグナリング関連分子の機能解析を可能とする。
関野祐子（東京大学医科学研究所神経ネットワーク）
神経活動に伴い細胞外に遊離するアデノシンは，脳の活動レベルを調節する因子として知られている。我々はこれまでに，内因性アデノシンがシナプス可塑性をも制御していることを報告してきた。テタヌス刺激（100 Hz 1秒間）で誘発する海馬CA1領域の長期増強は，アデノシンA2受容体拮抗薬により形成が阻害される。20 Hz以下のテタヌス刺激で誘発する長期増強ではテタヌス刺激直後の一過性シナプス伝達抑制により増強率が低下するが，アデノシンA1受容体拮抗薬はこの一過性シナプス伝達抑制を阻害する。さらに，長期増強の形成を阻止する低頻度テタヌス刺激（1 Hz 1000発）の脱長期抑制効果も，アデノシンA1受容体拮抗薬により阻害される。このように，内因性に神経細胞外に存在するアデノシンはシナプス可塑性を制御する因子であることは明らかであるが，学習記憶のメカニズムとの関与は未だ明らかではない。我々は，アデノシンA1受容体が海馬内情報処理を神経回路レベルでどのように制御しているかを解析し，アデノシンA1受容体と学習記憶メカニズムとの関連を明らかにすることを目的としている。本研究会では，ラット脳から精製したアデノシンA1受容体を用いて作製したポリクロナール抗体およびモノクロナール抗体により明らかにしたアデノシンA1受容体の海馬内分布と，さらに，CA3領域からCA1領域への興奮伝播に対するアデノシンA1受容体の役割について電気生理学的手法と膜電位変動の光学的測定法を用いて解析した結果を紹介する。
1．アデノシンA1受容体の海馬内分布と海馬回路機能調節
我々は，ラット脳アデノシンA1受容体特異的ポリクロナール抗体および新規に作製したモノクロナール抗体を用いて，海馬のCA2領域に他の領域と比べて高密度にアデノシンA1受容体が存在することを明らかにした(Neuroscience 93:955-967, 1999; J Comp Neurol 411: 301-316, 1999)。このことから，海馬CA2領域は海馬内の他の部位に比べて興奮性が低く保たれている可能性が高く，我々は「海馬CA2領域が脳内のアデノシン量の変動に応じてOn/Off機能を有するゲート部位である」という仮説を提唱した（神経研究の進歩 vol.45 (2) 283-296, 2001）。ラットでは海馬CA2領域は狭小であるが，サルやヒトでは発達してCA3,CA1とほぼ同等の細胞数となることから，CA2領域は高次情報処理に重要な部分であると考えている。
2．海馬スライス内興奮伝播回路の光学測定法による解析
膜電位感受性色素を使って膜電位変動を可視化する光学測定法により，海馬の歯状回−CA3−CA1神経回路での興奮伝播の時間空間パターンを解析して，CA2領域を飛び越えたCA3−CA1間の単シナプス経路以外に，CA2を経由するCA3−CA2−CA1伝播経路を見いだした。 (J Neurophysiol 78:1662-1668, 1997)。
アデノシンA1受容体が，CA2領域の興奮性を他の領域よりも低く抑えていると考えられるので，アデノシンA1受容体拮抗薬の作用を海馬スライス標本で電気生理学的に検証し，さらに拮抗薬の作用部位を光学測定法により解析したところ，CA3−CA2−CA1の興奮伝播が誘導されることがわかった。
Mandadi Sravan1・福見-富永知子1,2・柴崎貢志1,2・曽我部隆彰1・鈴木誠3・水野敦子3・富永真琴1,2
（1岡崎統合バイオサイエンスセンター・細胞生理部門，2総研大・生命科学・3自治医科大学・薬理学講座）
温度感受性TRPチャネルTRPV3, TRPV4は体温近傍の温かい温度を受容し，表皮ケラチノサイトに強く発現している。ケラチノサイトのTRPV3, TRPV4で感知された温度情報は感覚神経に電気信号として伝えられなければならない。そのために，神経伝達物質のような拡散性分子が存在すると仮定し，その分子の同定を試みた。
先ず，マウスケラチノサイトと感覚神経細胞の共培養系を確立し，温度刺激による細胞内Ca2+濃度の増加が先ず，ケラチノサイトで起こり，続いて感覚神経細胞で起こることを確認した。次に，バイオ分子センサーを用いたシステムを開発した。マウスのケラチノサイトと各種イオンチャネル型受容体（P2X2受容体，5-HT3受容体，NMDA受容体）を発現させたHEK293細胞を共培養し，HEK293細胞にパッチクランプを行いwhole-cell modeにした後，HEK293細胞を浮かせてケラチノサイトに近づけた。ケラチノサイトを温度刺激したときの各バイオ分子センサーによる陰性電位での内向き電流の発生を指標にして，ケラチノサイトから放出される物質の同定を試みた。ケラチノサイトからHEK293細胞を遠ざけた時にはケラチノサイトの温度刺激に電流がみられないことをnegative control，HEK293細胞に発現させた各受容体のリガンドを投与したときにはケラチノサイトから遠ざけても内向き電流がみられることをpositive controlとした。さらに，ケラチノサイトにおける温度受容にTRPV3, TRPV4どちらの温度感受性TRPチャネルがより関与しているかをTRPV3欠損マウス，TRPV4欠損マウスのケラチノサイトを用いて検証した。
Fernando Lopez-Redondo1, Kimiko Yamamoto2, Joji Ando2, Kishio Furuya1,
Takeshi Kobayashi3, Keiji Naruse4 & Masahiro Sokabe1,3,5
(1Cell Mechanosensing, SORST, JST; 2Dept Biomed Engin Grad Sch Med, Univ of Tokyo;
3Dept Cell Biophys, Nagoya Univ Grad Sch Med; 4Grad Sch Med, Dent & Pharmacy, Okayama Univ,
5Dept Mol Physiol, Natl Inst Physiol Sci)
Besides its broad utilization in vesicle recycling experiments, the styryl dye FM1-43 had been proved successful in the screening of activity-dependent channel activation (Meyers et al, J Neurosci 23:4054-4065,2003). Hair cells in mouse cochlear cultures are selectively labeled by brief exposure to FM1-43 only when the mechanotransduction channel at the tip links is open. P2X4 and TRPV1 channels also uptake FM1-43 in a ligand-gated fashion. Endothelial cells in vitro have a polygonal shape and the application of shear stress orients and elongate the cells in the direction of fluid flow. The mechanism of shear stress sensing has still not been elucidated. Our previous work clearly demonstrated a principal role of the ATP subtype receptor P2X4 in flow sensing by endothelial cells (Yamamoto et al, Nat Med 12:133-137, 2006; Yamamoto et al, Circ Res 87:385-391, 2000).
Here, we use confocal imaging technique to show FM1-43 uptake into HEK, HeLa and CHO cells transfected with the ATP receptor subtype P2X4 upon stimulation with ATP and local flow applied by a microtube located 200 mm over the cell surface. There is dose-dependency in the ATP-induced FM1-43 uptake. It is know that a point mutation in P2X4 (Y378F) affecting the internalization motif renders P2X4 on the membrane surface. Our results show that the continuous presence of P2X4 into the plasma membrane does not modify the pattern of FM1-43 uptake. The mechanical flow force produces a slight uptake of FM1-43 that increases highly if ATP is present in the perfusate solution. These results indicate functional activity of P2X4 in various heterologous systems and suggest that P2X4 could be a primary shear-stress sensor in endothelial cells.
豊満笑加，津田誠，井上和秀
（九州大学大学院薬学府・薬効解析学分野）
神経因性疼痛は，癌や糖尿病などによる神経障害によって引き起こされ，既存の鎮痛薬に抵抗性を示すことから臨床現場で非常に大きな問題となっているが，その発症メカニズムはいまだ不明な部分が数多く存在する。そのような中，当研究室での実験により，ATP受容体サブタイプP2X4受容体 (P2X4R) の発現増加が神経因性疼痛の発症に重要であるということ，P2X4Rの発現増加はミクログリアに特異的であることが明らかとなった(Tsuda et al. 2003)。したがって，ミクログリアにおけるP2X4Rの発現増加が神経因性疼痛発症に重要なステップであることが考えられる。しかし，この発現メカニズムは全くの謎である。最近我々は，細胞外マトリックス (ECM)のひとつであるフィブロネクチン(FN) がP2X4Rの発現制御に関与していることを明らかにした (Nasu-Tada et al. 2006)。そこで本研究では，FNによるミクログリアでのP2X4Rの発現増加に関わるインテグリン分子の同定，及び，細胞内シグナル伝達経路の解明を目指した。
ラット初代培養ミクログリアをFNで処置することにより，P2X4Rの発現は著明に増加し，この発現増加はエチスタチン（a5b1，a IIb b 3，aV b 3インテグリン阻害剤），及び，b1インテグリン機能阻害抗体の前処置により抑制された。また，ミクログリア細胞は，a5およびb1インテグリンタンパク質を共に発現していたことから，FNはa5 b 1インテグリンを介してP2X4Rの発現を亢進していると考えられる。FNによるP2X4Rの発現増加は，MEK阻害剤U0126やPI3K阻害剤LY294002で抑制された。さらに，FN処置により，リン酸化ERK（活性化型）の発現レベルが上昇し，その細胞内分布は核周辺で顕著に見られた。そこで，ERKの下流に存在する転写因子CREBの活性化を検討したところ，FNによりリン酸化CREBの発現がミクログリアの核内で著明に増加した。興味深いことに，CREBのリン酸化は，U0126およびLY294002により抑制されたが，ERKのリン酸化はU0126のみで抑制された。
以上の結果より，FNが情報伝達するインテグリンはa5 b 1であり，その下流で活性化されたPI3KおよびERKがP2X4Rの発現増加に関与することを明らかにした。さらに，PI3KとERKは独立した経路でCREBをリン酸化することも示した。P2X4Rのプロモーター領域には，CREB結合領域が存在することから，P2X4RはCREBを介して転写レベルで制御されている可能性が考えられる。
長谷川茂雄，津田誠，井上和秀
（九州大・薬・薬効解析）
糖尿病や末期癌などに伴う末梢神経等の損傷や変性により，触刺激を激烈な痛みと感じてしまうアロディニア（異痛症）を主症状とした神経因性疼痛が発症する。神経因性疼痛は非ステロイド性抗炎症薬やオピオイドなどの既存の鎮痛薬が奏効しない難治性疼痛であり，その発症メカニズムには不明な点が多く，現在までのところ，有効な治療法が確立されていない。このような状況の中，近年，ATPと難治性疼痛との関連に大きな注目が集まっており，末梢の一次求心性神経に発現しているP2X3およびP2X2/3受容体が，炎症性疼痛や神経因性疼痛における痛覚過敏やアロディニアに関与していることが示唆されている。一方，プロスタグランジン類をはじめとする脂質メディエーターもATPと同様に痛みに関与していることから，それらの産生酵素である細胞質型ホスホリパーゼA2 (cytosolic phospholipase A2; cPLA2) の活性化が痛覚伝達系の制御に重要な役割を担っている可能性が推察できる。細胞レベルでは，ATPによりcPLA2が活性化されることから，本研究では，後根神経節細胞 (dorsal root ganglion; DRG) におけるcPLA2の活性化およびこの活性化に対する選択的P2X3およびP2X2/3受容体アンタゴニストの効果について検討した。
cPLA2の活性化は，活性化型であるSer505リン酸化型cPLA2 (phosphorylated cPLA2; phospho- cPLA2) タンパク質をその特異的抗体を用いた免疫組織染色法により検出し，その発現レベルから評価した。神経因性疼痛病態モデルでは，損傷側DRGニューロンにおいて，phospho-cPLA2の発現レベルの増加および細胞膜近傍へのトランスロケーションが観察された。一方，慢性炎症性疼痛病態モデルではこのような現象は見られなかった。phospho-cPLA2の細胞膜へのトランスロケーションは主に大型DRGニューロンにおいて観察され，また，このようなphospho-cPLA2陽性ニューロンは神経損傷後経時的に増加し，この経時変化は神経損傷によるアロディニア発現の経時変化とほぼ一致した。cPLA2には4つのサブタイプ (a，b，g，d) が存在し，その中でもcPLA2aはアラキドン酸を含むリン脂質に選択性を示し，脂質メディエーターの産生に特に重要であることが知られている。そこで，選択的cPLA2 a阻害剤を髄腔内投与した結果，アロディニアが抑制されると同時に，損傷側DRGニューロンにおけるphospho-cPLA2の発現レベルが低下した。さらに，選択的P2X3およびP2X2/3受容体アンタゴニストであるA-317491により，phospho-cPLA2の発現レベルと細胞膜へのトランスロケーションが抑制された。以上の結果より，DRGニューロンにおけるP2X3およびP2X2/3受容体を介したcPLA2の活性化および細胞膜へのトランスロケーションは神経損傷時に特異的に誘発される現象であり，神経因性疼痛に重要な役割を果たしていることが示唆される。
濱千紘1，原田佳奈1，宮野加奈子1，松林弘明2,3，酒井規雄2，秀和泉1，仲田義啓1
（広島大院・医歯薬 1薬効解析，2神経・精神薬理，3広島工大・健康情報）
a7ニコチン性アセチルコリン受容体（a7受容体）は主に神経細胞に発現し，神経保護などの機能を果たすことが知られている。しかし近年，マクロファージやアストロサイトなどの非神経細胞においてもa7受容体の発現が報告されている。我々は，ラット脳ミクログリアにおけるa7受容体の発現を確認したが，ミクログリアのa7受容体は神経細胞に発現するイオンチャネル型のa7受容体とは異なり，PLC活性化とIP3生成を介して細胞内ストアからのCa2+遊離を引き起こす新しいタイプの受容体であることが示唆された。さらに，ミクログリアのa7受容体が，JNKおよびp38の活性化抑制を介した転写後調節によりLPS刺激による傷害的なTNF遊離を抑制する一方で，ATP/BzATP刺激によるP2X7受容体を介した保護的なTNF遊離を増強することを見出した。そこで今回，a7受容体によるATP/BzATP誘発TNF遊離促進の機序を解明するとともに，TNF遊離制御におけるPLC/IP3経路の関与を検討した。
ラット脳ミクログリア初代培養細胞において，ATP/BzATPはMAPキナーゼ (ERK，JNK，p38) を活性化し，TNF mRNA発現を誘導する。ニコチンはこのATP/BzATPの作用には無影響であった。BzATPはP2X7受容体を介して [Ca2+]i 上昇を引き起こすが，ニコチンはこの作用を増強した。さらにニコチンは，LPS誘発TNF遊離を抑制したが，この作用はIP3受容体遮断薬xestospongin Cにより消失した。
以上の結果より，ミクログリアに発現するa7受容体はP2X7受容体のイオンチャネル機能を高め，MAPキナーゼ非依存的な経路で転写後段階を調節することにより，ATP/BzATP誘発TNF遊離を促進する可能性が示された。また，a7受容体はPLC/IP3経路を介してTNF遊離を制御し，ミクログリアの神経保護機能を高める可能性が示唆された。
川村将仁，川村将弘
（東京慈恵会医科大学・薬理学講座第1）
アストロサイトが自発的カルシウム・オシレーションを引き起こすことはグリア細胞において観察される自発活動の一例として知られている。近年，グリア細胞が神経伝達物質（ATP，glutamate等）の放出を介してグリア間および神経細胞間伝達に積極的に関与している可能性が示されてから，アストロサイトの細胞内カルシウム動態がさらに注目されるようになった。しかし，自発的カルシウム・オシレーションの調節機構およびその機能的役割については未解明である。本研究では海馬アストロサイトにおける自発的カルシウム・オシレーションの調節機構を解明するために，細胞外ATPによる自発的カルシウム・オシレーションの頻度変化について，海馬スライス培養標本によるカルシウム・イメージング法を用いて検討した。
ATPは海馬CA3領域上昇層においてアストロサイトの細胞内カルシウム濃度を一過性に上昇させた後，投与後20分以上持続する自発的カルシウム・オシレーションの頻度増加を引き起こした。(1) AdenosineおよびNECAがカルシウム・オシレーションの頻度を増加したこと，(2) CGS15943およびMRS1754がATPによるカルシウム・オシレーション頻度増加を抑制したことから，ATPによる自発的カルシウム・オシレーションの頻度増加は，ATPがadenosineに加水分解された後に活性化されるadenosine A2B受容体を介していると考えられた。一方，ATPによる一過性細胞内カルシウム濃度上昇はP2Y1受容体およびadenosine A2B受容体の活性化を介していた。
細胞外ATPがP2Y1受容体およびadenosine A2B受容体という異なる二つの受容体を活性化することにより，アストロサイトの細胞内カルシウム濃度および自発的カルシウム・オシレーション頻度の調節を担っていると考えられる。
Hongtao Liu, Sabirov Ravshan, 岡田泰伸（生理研機能協関）
ATP and glutamate represent two important signaling molecules involved in bidirectional glia-neuron communication in both physiological and pathological conditions. Our previous studies demonstrated that the maxi-anion channel and the volume-sensitive outwardly rectifying (VSOR) chloride channel jointly serve as conductive pathways for glutamate release from primary cultured mouse astrocytes subjected to hypotonic stress or chemical ischenia. In the present study, we tested a possible role of the maxi-anion channel in ATP release from primary cultured mouse astrocytes subjected to oxygen-glucose deprivation (OGD) stress. In response to OGD stress, astrocytes exhibited massive release of ATP as detected by a luciferine-luciferase assay. Using a biosensor technique, it was demonstrated that the local concentration of ATP reaches a level of approx. 4 mM, which is sufficient to activate most types of purinergic receptors. The OGD-induced ATP release was inhibited by blockers of maxi-anion channel (Gd3+ and arachidonic acid), but not by inhibitors of other candidate pathways for ATP release, such as gap junction hemichannel, CFTR, MRP, VSOR, exocytosis, P2X7 receptor and pannexin. The same maneuver caused activation of the maxi-anion channels similar to those activated by hypotonicity and chemical ischemia. The channels were found to be permeable to the anionic form of ATP with the permeability ratio of ATP/Cl of 0.11 ± 0.01. The OGD stress also induced activation of maxi-anion channel in astrocytes in the acutely isolated brain slices from mice expressing GFP protein under the control of GFAP promoter. Therefore, it is concluded that the maxi-anion channel serves as the pathway for ischemia-induced ATP release from astrocytes in vitro. Also it is likely that the maxi-anion channel mediates ATP release from astrocytes in the brain in situ.
古家喜四夫1，志内伸光2，曽我部正博1,2
（1科学技術振興機構・細胞力覚，2名古屋大学大学院・医・細胞生物物理）
生体における普遍的な細胞外情報伝達物質であるATPは，細胞の機械的刺激によって放出され，機械刺激受容や機械刺激情報伝達のキー分子とも考えられる。授乳期の乳腺において乳腺腺胞は，腺胞内のミルクを射出するため下垂体後葉から内分泌されたオキシトシンによって収縮したり，腺胞内に溜まっていくミルクによって膨張したり，外部からの機械刺激を受けるなど，生理的条件下で種々の大きな機械的ストレスを受けている。
私たちはマウスの授乳期乳腺の初代培養細胞系を用いて，乳腺細胞がタッチやストレッチといった機械刺激に非常に敏感で刺激によってATPを放出し，乳腺分泌細胞が持つP2Y2や乳腺筋上皮細胞が持つP2Y1の活性化を介してCa2+シグナルが伝播することなどを明らかにし，乳腺腺胞においてATPシグナリング系が乳汁分泌の増強や制御に重要な寄与をしていることを示唆してきた。
今回の発表では，より生体内に近い状態にある乳腺の組織サンプルでのATPシグナリングの様子を，Luciferin- Luciferaseバイオルミネッセンスを用いたリアルタイムATPイメージングシステムにより明らかにする。乳腺組織を数mm角程度に細切しコラーゲンゲルに埋め込んだ組織サンプルは一週間以上にわたり機能，形態を維持している。このサンプルにタッチ刺激やストレッチ刺激を与えると用量依存的にATP放出が見られた。その放出濃度をルミネッセンス強度から定量すると数mMから10mMであった。またオキシトシンの投与によってもATP放出が見られた。これらのことは乳腺においてメカノシグナリングとATPシグナリングがカップルし乳汁分泌に関与しているという私達の考えを確証している。
末石浩二1,2，多田薫1，藤下加代子1，片岡泰文2，小泉修一1
（1国立衛研・薬理部，2福岡大学・薬・薬学疾患管理）
血管周皮細胞（ペリサイト）は，微小血管や毛細血管の血管壁外周に位置する細胞で，特に網膜や脳に多く存在していることが知られているが，その詳細な機能については不明な部分が多い。脳内では，血液脳関門 (BBB) の構成員として機能する他，血管形成の際に重要な役割を担うと言われている (Bergers & Song, 2005)。血管新生の際には，血管の一部を分解して新生血管の道筋を作る必要がある。血管基底膜はラミニン，ファイブロネクチン，コラーゲンなどの細胞外マトリックス (ECM) から構成されており，ECM を分解するたんぱく質としてマトリックスメタロプロテアーゼ (MMPs) が知られている。MMPs は細胞からpro-体として分泌された後，プラスミン，活性酸素等の作用を受けて活性型 MMPsとなる。MMPs の中でもとくに血管新生との関与が示唆されている分泌型ゼラチナーゼの一つ MMP-9 は，細胞内 Ca2+濃度 ([Ca2+]i) 依存的に放出されることが示唆されている (Gu & Wiley, 2006)。私達はこれまでに，ペリサイトとアストロサイトが近接して存在し共に毛細血管を取り囲んでいること，種々の機能的P2受容体を発現していること，さらに両者がATPを介してコミュニケーションを取り[Ca2+]i上昇等の応答を呈すること，を明らかにしてきた。そこで今回私達は MMP-9 に注目し，ATP/P2 受容体シグナルを介したペリサイトおよびアストロサイトでの MMP-9 産生・放出能について検討を行った。その結果ペリサイトでは，BzATP 処置群及び apyrase 処置群の培地上清中の pro-MMP-9 含有量増加が観察された。つまりペリサイトは ATP の枯渇時，または高濃度ATP存在下でおそらくP2X7受容体を介してMMP-9を産生・放出するものと考えられる。一方アストロサイトでは，P2受容体シグナルを遮断する条件下で pro-MMP-9 放出量の増加が見られ，この応答に関与する責任受容体はGi共役型P2Y受容体であった。また，その応答の過程には TNF-aが深く関与することが示唆された。種々の病態時や血管等の細胞損傷時に細胞外へのATP放出・漏出は亢進すること，またこのとき細胞外ATP分解酵素発現が亢進することが知られている。このように，ペリサイトまたはアストロサイトはATP 濃度の急激な変化に伴って異なるメカニズムで MMP-9を産生・放出し，その後の生理及び病態生理的応答の一端を担っている可能性が示唆された。
小林大策1，大久保聡子2，中畑則道1
（1東北大学・院・薬・細胞情報薬学分野，2国立衛研・薬理）
皮膚はヒトの全身を覆い，一種の防御壁として周囲の環境からの様々なダメージから生体を保護しており，皮下組織，真皮，そして表皮及びその付属器とから構成されている。ケラチノサイトとは皮膚の中でも最も上層に位置する表皮の角化細胞を指し，真皮との境界に存在している基底細胞から有棘細胞，顆粒細胞，そして角質細胞へと徐々に分化していき，最終的にいわゆる「あか」となって剥がれ落ちていく。このようにケラチノサイトは皮膚の中でも最も外側に位置しているために物理的刺激，もしくは温度変化といった何らかの刺激に常にさらされている。最近の研究からケラチノサイトを含む様々な細胞において，物理的刺激に応じて細胞内から細胞外へATPが放出され，様々な生理作用をもたらすことが報告されている。ルシフェリン-ルシフェラーゼ法を用いて，培地交換という物理的刺激の前後においてケラチノサイトの株化細胞であるHaCaT細胞の培養上清中のATP量を測定したところ，培地交換から数秒後の培養上清中には静置時の約60倍ものATPが含まれていた。一方，放出されたATPは，ATP感受性のP2XもしくはP2Y受容体を介して自分自身もしくは周囲の細胞に対して様々な生理作用をもたらすことが知られている。これまで我々は，HaCaT細胞に，様々なP2プリン受容体サブタイプが発現し，その中でもATP，UTPをアゴニストとするP2Y2受容体が豊富に発現することを報告してきたが，皮膚におけるP2受容体の生理的意義については未だ明らかではない。そこで，本研究ではHaCaT細胞を用い，P2Y2受容体を介する薬理作用について解明することを試みた。
HaCaT細胞をP2Y2受容体アゴニストUTPで刺激すると，細胞内Ca2+濃度上昇と共にホスファチジルイノシトールリン脂質代謝回転の亢進がみられた。一方，UTPによる刺激後約30分をピークとしてサイトカインの一種であるインターロイキン6 (IL-6) mRNAの発現が上昇した。さらに，ELISA法によりHaCaT細胞培養上清中に含まれるIL-6タンパク質量を測定したところ，UTPによる刺激後約3時間をピークとして時間依存的にIL-6タンパク質量が増加した。これらの反応はUTPの濃度依存的に生じ，suraminやBAPTA-AMによって抑制されたが，GF109203Xには影響されなかった。
以上のことから皮膚表皮のケラチノサイトにおいて，P2Y2受容体刺激により細胞内Ca2+濃度上昇を介してIL-6産生が促進することが示唆された。
前畑真知子，月本光俊，原田均，五十里彰，高木邦明，出川雅邦
（静岡県立大・薬）
【目的】T細胞上に発現するP2X7受容体は，リガンドであるATPとの結合により活性化され，小孔の形成，細胞縮小を伴った細胞死を誘導する[1]。一方，最近T細胞表面に発現するecto-ADP-ribosyl-transferase 2(ART2)が細胞外に放出されたNADを基質としてP2X7受容体をADPリボシル化することにより活性化する可能性が報告されている[2]。そこで，本研究ではP2X7受容体活性化機構の解明を目的に，ATPおよびNADによるマウスＴ細胞の細胞死誘導機構の差違について解析した。
【方法】4-5週齡雄性BALB/cマウスより調製した脾臓細胞を用い，ATPならびにNAD処置による小孔の形成，細胞径の変化，ホスファチジルセリン (PS) の細胞表面への露出ならびに細胞死の誘導への影響について比較検討した。
【結果および考察】ATP処置10分後に細胞径の縮小（細胞縮小）を伴ったエチジウムイオンの強い取り込み（小孔形成），ならびにPSの細胞表面への露出が，90分後にはプロピジウムイオンの取り込み（細胞死の誘導）が観察された。細胞膜抗原により脾臓細胞の細胞種を分別して解析した結果，ATPに応答して細胞死を誘導した細胞群はT細胞であった。一方，NAD処置では，ATPに比べて小孔の形成は弱く，細胞縮小はほとんど観察できなかった。また，細胞死の誘導能もATPに比べると弱かったが，PSの細胞表面への露出は反対に強かった。
以上より，ATPとNADによるP2X7受容体活性化には異なる機構が存在することが示唆され，それぞれが果たす役割に違いがあるものと考えられた。PSの細胞表面への露出は，マクロファージによる貪食に重要とされるが，T細胞の遊走，組織への接着・浸潤に関わるという報告もあり，NADによるP2X7受容体活性化を介した役割を考える上で興味深い。
参考文献
[1] Tsukimoto M, Maehata M, Harada H, Ikari A, Takagi K, Degawa M (2006) J Immunol 177:2842-2850.
[2]Seman M, Adriouch S, Scheuplein F, Krebs C, Freese D, Glowacki G, Deterre P, Haag F, Koch-Nolte F (2003) Immunity 19:571-582.
右田啓介，趙玉梅，桂木猛
（福岡大・医・薬理）
ATPはすべての細胞に存在し，細胞内外で重要な物質である。細胞内外の輸送は，小胞輸送，トランスポーター，チャネルにより行われている。また，細胞内外にはATP分解酵素が存在し，ADP，AMP，アデノシンへと代謝される。これらの代謝産物も細胞内外で重要な役割を担っている。ATPは細胞内に高濃度存在することが知られている。細胞を機械刺激，低浸透圧刺激あるいは受容体刺激すると，ATPは細胞外へ放出される。放出されたATPは受容体と結合し生理作用を示し，代謝あるいは取り込みにより細胞外から除去される。一般的にATPはアデノシンに代謝されてから細胞外に取り込まれると考えられている。しかし，細胞が損傷し高濃度のATPが細胞外に漏出した場合は，ATP，ADP，AMPが直接細胞内に取り込まれる可能性も考えられる。そこで，本研究では，アデニンヌクレオチドの取り込みについて検討を行った。放射ラベルされたアデノシン，AMP，ADP，ATPは，MDCK細胞に経時的・濃度依存的に細胞内へ取り込まれた。AMP，ADP，ATPの取り込みはアデノシンの取り込みに比べると少量であった。また，アデノシン，AMP，ADP，ATPの取り込みはヌクレオシドトランスポーター拮抗薬のジピリダモールとNBTIにより濃度依存的に抑制された。次に，細胞内のATPが減少したときの取り込みについて検討した。ミトコンドリア拮抗薬のCCCPとアンチマイシンはアデノシン，AMP，ADP，ATPの取り込みを抑制した。しかし，2デオキシグルコースで細胞内ATP量を減少させると，AMP，ADP，ATPの取り込みは上昇したが，アデノシンの取り込みは変化がなかった。また，グルコース除去溶液やショ糖置換溶液では細胞内ATPは有意に減少せず，AMP，ADP，ATPの取り込みも増加は見られなかった。これらのことから，2デオキシグルコースで解糖系が抑制され極端に細胞内ATPが減少したとき，細胞外からのAMP，ADP，ATPの取り込みが細胞内ATPを補充するために増加する可能性が示唆された。
藤森廣幸，宮本晃洋，芳生秀光
（摂南大・薬・衛生分析化学）
細胞内に存在するアデノシン3’- 一リン酸 (3’-AMP) は，アデニル酸シクラーゼ(AC) の内因性阻害物質とされており，ACのP-siteにアロステリック的に作用し，cAMP の生成を制御していると考えられている。3’-AMP はある種の RNA分解酵素（3’-AMP 産生酵素）がmRNA のpoly(A)tail等を加水分解する際の反応生成物であると考えられている。しかし，3’-AMPおよびその産生酵素に関する生体内意義は未だ不明である。
我々は，マウス大脳の3’-AMP産生酵素活性は加齢に伴って大きく変動するが，小脳の産生酵素活性はあまり変動しないことを認めた。解剖学的には，脳は大脳（前頭葉等），海馬，中脳，線条体，視床下部，橋・延髄，小脳等に分画できる。本研究では，前頭葉，海馬，視床下部等に本当に3’-AMP産生酵素が存在するのか検討すること。また，糖尿病誘発剤ストレプトゾトシン (STZ) により，神経障害を起こすことが知られているので，STZ 投与時に脳の3’-AMP産生酵素活性が変動するのか等を含め基礎的検討を行った。
マウスの腹腔内にSTZを投与し，糖尿病を誘発させ，摘出した脳を常法に従って，8画分に分けた。3’-AMP産生酵素活性は基質poly(A)を用いて測定した。3’-AMP等のadenine類は標識試薬chloroacetaldehydeで蛍光化した後，HPLC法により分離・定量した。
小脳の3’-AMP 産生酵素活性は他の7部位に比べ，最も低かった。小脳の活性に比べ，前頭葉，脳の残部，海馬，視床下部の産生酵素活性は約6倍から10倍高かった。STZ 投与群の視床下部の産生酵素活性は対照値に比べ減少傾向が認められた。しかし，他の7部位の同活性は STZ 投与しても変化しなかった。以上の結果より，3’- AMP産生系は前頭葉，海馬，視床下部において何らかの生体内意義を担っている可能性がある。また，STZ は視床下部の3’-AMP産生酵素系に何らかの影響を及ぼしていることが示唆された。
