生理学研究所年報 第30巻
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22.TRPチャネルの機能的多様性とその統一的理解

2008年6月5日-6月6日
代表・世話人:森 泰生(京都大学 大学院工学研究科)
所内対応者:富永真琴(生理学研究所・岡崎統合バイオサイエンスセンター)

(1)
網膜ON型双極細胞におけるTRPM1の機能
小池千恵子,古川貴久(大阪バイオサイエンス研究所 発生生物学部門)

(2)
酸化ストレス感受性チャネルTRPM2の生理的意義の解明
山本伸一郎,清中茂樹,高橋重成,森 泰生
(京都大学工学研究科 合成・生物化学専攻)

(3)
プロトンチャネルとしてのTRPM7
沼田朋大1,2,岡田泰伸11生理学研究所 機能協関部門,
2京都大学工学研究科 合成・生物化学専攻)

(4)
TRPM8による体温制御
細川 浩1,田地野浩二1,前川真吾1,松村 潔2,小林茂夫1
1京都大学 情報学研究科知能情報学 生体情報処理分野,
2大阪工業大学 情報科学部)

(5)
TRPM2 channelの単粒子解析による構造解明
丸山雄介1,小椋俊彦1,三尾和弘1,清中茂樹2,加藤賢太2,森 泰生2,佐藤主税1
1産業技術総合研究所 脳神経情報研究部門,
2京都大学大学院 工学研究科 合成生物化学)

(6)
TRPV1チャネルの細胞外ナトリウムイオンによる活性調節
太田利男1,今川敏明2,伊藤茂男1
(1北海道大学 大学院獣医学研究科 形態機能学講座,
2北海道大学 大学院先端生命科学院 先端細胞機能学)

(7)
TRPV2による細胞骨格・細胞運動の制御
小島 至,長澤雅裕,中川祐子(群馬大学 生体調節研究所細胞調節分野)

(8)
細胞間接着に依存した皮膚バリア機能におけるTRPV4チャネルの重要性
曽我部隆彰1,島貫恵実1,米村重信2,水野敦子3
富永真琴1,4,福見-富永知子1,4
1岡崎統合バイオサイエンスセンター(生理学研究所)細胞生理,
2理研 発生・再生科学総合研究センター,3自治医大 薬理学講座,
4総研大 生命科学専攻)

(9)
Essential role of STIM1, ER calcium sensor,
for store-operated calcium influx and mast cell activation
馬場義裕,黒崎知博(大阪大学 免疫学フロンティア研究センター,
理研 免疫アレルギー科学総合研究センター)

(10)
毛様体筋収縮調節に関与する非選択性陽イオンチャネルとTRPCチャネル
高井 章,宮津 基,安井文智(旭川医大 生理・自律機能分野)

(11)
活性化アストロサイトにおけるTRPC3の生理的意義
白川久志,中尾賢治,杉下亜維子,中川貴之,金子周司
(京都大学 薬学研究科 生体機能解析)

(12)
脊髄におけるシナプス前TRPA1チャネルの機能的意義について
中塚映政(佐賀大学 医学部生体構造機能学講座)

(13)
TRPV4の活性化を介したアストロサイトの興奮:神経-グリア機能連関の解明
柴崎貢志1,2,3,富永真琴1,2,3
1岡崎統合バイオサイエンスセンター 細胞生理研究部門,
2生理学研究所 細胞生理研究部門,
3総合研究大学院大学 生命科学研究科 生理科学専攻)

(14)
PKCg によるTRPC3の制御の異常と脊髄小脳変性症(SCA14)発症の関係について
齋藤尚亮(神戸大学 バイオシグナル研究センター)

(15)
エンドセリンA型受容体を介したCa2+シグナリングの多様性とTRPCチャネル
堀之内孝広,三宅由美恵,西屋 禎,西本 新,三輪聡一
(北海道大学大学院 医学研究科細胞薬理学分野)

(16)
Snapinをアダプターとする受容体作動性Ca2+流入機構
鈴木史子,森島 繁,田中高志,村松郁延(福井大学 医学部 薬理学領域)

(17)
副腎髄質細胞におけるCa流入経路とTRPCチャネル
井上真澄(産業医科大学 医学部第2生理学)

(18)
Counteracting effect of TRPC1-associated store-operated Ca2+ influx on TNFa induced COX2-dependent PGE2 production in human colonic myofibroblasts
Hai Lin, Yasuhiro Kawarabayashi, Akira Honda, Ryuji Inoue
(Department of Physiology, Graduate School of Medical Sciences,
Fukuoka University)

(19)
心筋細胞におけるP2Y受容体-TRPC5機能的共役の意義
西田基宏(九州大学大学院 薬学研究院薬効安全性学分野)

【参加者名】
三輪聡一,堀之内孝広(北海道大学医学研究科),太田利男(北海道大学獣医学研究科),高井 章,宮津 基(旭川医科大学生理学講座),吉田卓史(東北大学歯学研究科),小島 至,中川祐子,長澤雅裕(群馬大学生体調節研究所),佐藤主税,三尾和弘(産業技術総合研究所),小林俊介,金子祐次,垣花優子(昭和大学薬学研究科),森島繁(福井大学医学部),渡邊泰秀(浜松医科大学医学部看護学科),山村寿男,大野晃稔,舩橋賢司,村田秀道(名古屋市立大学薬学研究科),森 泰生,沼田朋大,山本伸一郎,加藤賢太,金子 雄,眞本達生,香西大輔,澤口諭一(京都大学工学研究科),桑原宏一郎,木下秀之,桒原佳宏,山田優子,横井秀基(京都大学医学研究科 内分泌代謝内科),小林茂夫,細川 浩,澤田洋介(京都大学情報学研究科 知能情報学専攻),金子周司,白川久志,金野真和(京都大学薬学研究科),古川貴久,小池千恵子(大阪バイオサイエンス研究所),斎藤尚亮(神戸大学先端融合研究環バイオシグナル研究センター),成瀬恵治(岡山大学大学院 医歯薬学総合研究科),西田基宏(九州大学大学院 薬学研究院),井上真澄(産業医科大学医学部),海 琳(福岡大学医学部),飯山準一(熊本保健科学大学保健科学部),中塚映政(佐賀大学医学部),松下正之(三菱化学生命科学研究所),天野賢一(持田製薬総合研究所),長浦 健(小野薬品工業株式会社),辻田隆一(旭化成ファーマ),富永真琴,山中章弘,柴崎貢志,稲田 仁,曽我部隆彰,梅村 徹,小松朋子,Boudaka Ammar,内田邦敏,加塩麻紀子,常松友美,周 一鳴,高山靖規,三原 弘,川口 仁(岡崎統合バイオサイエンスセンター),佐藤かお理,長友克広,上條真弘,Toyehies(生理学研究所),檜山武史,張 藍帆,西原 絵里(基礎生物学研究所)


【概要】
 平成20年6月5及び6日に研究会が行われた。19題の発表があり,TRPCチャネルについて8題,TRPVチャネルについて4題,TRPMチャネルについて5題,TRPAチャネルについて1題,STIM1につて1題であった。毎年,新しいTRPチャネル研究者が集い,このチャネル研究の広さをあらためて実感したが,お互いの研究内容についての討論・情報交換が行われた。具体的には,大阪バイオ小池(以下敬称略)が網膜双極細胞のTRPM1,京都大山本が免疫細胞のTRPM2,生理研沼田がHeLa細胞のTRPM7,京都大細川が感覚神経細胞のTRPM8の機能を発表し,産総研の丸山がTRPM2の単粒子解析による構造を示した。そして,岡崎統合バイオの曽我部が表皮ケラチノサイトのTRPV4,群馬大小島がマクロファージのTRPV2,岡崎統合バイオの柴崎がアストロサイトのTRPV4の機能に関して発表した。北海道大太田はTRPV1の細胞外Na+による制御機構を示した。佐賀大中塚は脊髄におけるTRPA1の機能を報告した。旭川医大高井は毛様体筋のTRPC,京都大白川はアストロサイトのTRPC3,産業医大井上は副腎髄質細胞のTRPCの発現と生理的意義を発表した。神戸大齊藤はPKCg によるTRPC3制御を,北海道大堀之内はエンドセリンAによるTRPC制御を,福井大森島はSnapiによるTRPC6制御を示した。また,福岡大Linが結腸筋繊維芽細胞におけるTNFaによるTRPC1制御,九州大西田が心筋細胞でのATP刺激によるTRPC3, TRPC5, TRPC6を介した細胞内Ca2+シグナリングメカニズムを報告した。加えて,大阪大馬場は注目を浴びているStim1のマスト細胞における機能を示した。いずれもレベルの高い発表であり,日本におけるTRPチャネル研究の発展を確信した。

 

(1) 網膜ON型双極細胞におけるTRPM1の機能

小池千恵子,古川貴久(大阪バイオサイエンス研究所 発生生物学部門)

 網膜視細胞において光は神経シグナルに変換される。神経シグナルは介在ニューロンである双極細胞を経て,神経節細胞を介して視覚中枢へと伝達される。光刺激により網膜視細胞は過分極し,神経伝達物質であるグルタミン酸の放出が減少する結果,ON型双極細胞においてmGluR6 が脱活性化し,下流のカチオンチャネルが開いて脱分極応答が発生する。現在までにこのカチオンチャネルは同定されていない。我々は網膜内層に特異的に発現している遺伝子としてTRPM1を見いだした。TRPM1は,メラノーマ細胞の転移能と発現が逆相関する遺伝子でありmelastatinとして知られていたが,その機能は不明であった。我々はTRPM1 long formの抗体を作成することにより,TRPM1がON型双極細胞の細胞体と樹状突起の先端に発現し,mGluR6と共局在することを明らかにした。TRPM1ノックアウトマウスを作成したところ,ノックアウトマウスの網膜において層構造の異常は見られず,また,双極細胞の成熟分化マーカーの発現にも異常はみられなかった。しかし,TRPM1ノックアウトマウスで電気生理学的な解析を行ったところ,ERGのb波(主としてON型双極細胞由来)が欠如していることが明らかとなった。網膜スライス標本にホールセルクランプ法を適用した結果,TRPM1ノックアウトマウス網膜においてはON型双極細胞のみが光刺激に応答せず,さらにTRPM1の活性を抑制するE3抗体は,野生型マウス網膜の光応答を抑制することが明らかとなった。さらに,TRPM1強制発現細胞においてCa2+influx実験およびパッチクランプ実験を行ったところ,TRPM1はCa2+透過性を示すことが明らかとなった。以上の結果は,TRPM1が長い間不明であったON型網膜双極細胞のmGluR6シグナル下流に位置するカチオンチャネルである可能性を強く示唆するものである。

 

(2) 酸化ストレス感受性チャネル TRPM2 の生理的意義の解明

山本伸一郎,清中茂樹,高橋重成,森 泰生
(京都大学工学研究科 合成・生物化学専攻)

 Reactive oxygen species (ROS) induce chemokines responsible for the recruitment ofinflammatory cells at inflamed sites in injury or infection. Here, we demonstrate that theplasma membrane Ca2+-permeable channel TRPM2 controls ROS-induced chemokineproduction in monocytes. In human U937 monocytes, H2O2 evokes Ca2+ influx throughTRPM2 to activate Ca2+-dependent tyrosine kinase Pyk2 and amplify Erk signal via Ras.This elicits nuclear translocation of NF-kB essential for the production of the chemokine interleukine-8 (CXCL8). In monocytes from Trpm2-defecient mice, H2O2-induced Ca2+ influxand production of the macrophage inflammatory protein-2 (CXCL2), the mouse CXCL8functional homologue, were impaired. In the inflammation model dextran sulfate sodium-induced colitis, CXCL2 expression, neutrophil infiltration, and ulceration were attenuated by Trpm2 disruption. Thus, TRPM2 Ca2+ influx controls the ROS-induced signal cascade responsible for chemokine production which aggravates inflammation. We propose functional inhibition of TRPM2 channels as a new therapeutic strategy for treating inflammatory diseases.

 

(3) プロトンチャネルとしてのTRPM7

沼田朋大1,2,岡田泰伸11生理学研究所機能協関部門,
2京都大学工学研究科 合成・生物化学専攻)

 TRPM7は広範に発現する非選択性の陽イオンチャネルであり,細胞周期,細胞増殖,細胞死にかかわることが知られている。現在まで,TRPM7は1価カチオンおよび2価カチオンを透過させるチャネルであるという報告はあるがプロトンそのものの透過については,知られていない。本研究では,パッチクランプ法でTRPM7を発現させたHEK293T細胞でプロトンの透過の有無を検討した結果,内向き整流性の比較的大きなプロトン電流が観察された。また,このプロトン電流に対する生理的濃度のCa2+とMg2+の影響の実験結果から,pH5.5付近でプロトンは2価カチオンと同じ結合サイトを競合して透過することが分かった。そこで,TRPM7におけるプロトンの通り道と考えられるポア領域の負電荷アミノ酸を中性化する点変異(E1047A, E1052A, D1054A, D1059A)を導入した結果,D1054Aでは,電流が大きく抑制され,E1052A, D1059Aでは,部分的に抑制された。これらのことより,プロトンはTRPM7のポア領域における負電荷アミノ酸部位を介して流入していることが明らかとなった。ところで,子宮頚部では,常にpH4からpH5付近の強い酸性状態に保たれている。そこで,子宮頸部上皮由来のHeLa細胞を用いて実際にTRPM7の活性を確認した。この結果,発現系と同様のプロトン電流が観察され,siRNAを用いたノックダウンによってこれが大きく抑制された。これらの結果より,子宮頚部でTRPM7を介するプロトン流入が生理的条件においても機能している可能性が示唆された。

 

(4) TRPM8による体温制御

細川 浩1,田地野浩二1,前川真吾1,松村 潔2,小林茂夫1
1京都大学 情報学研究科知能情報学 生体情報処理分野,
2大阪工業大学 情報科学部)

 末梢神経に発現しているTRPM8は冷却や,冷感物質であるメンソールに応答することから,皮膚の冷受容器であると考えられている。恒温動物の芯部体温は,芯部温による調節と,皮膚温による調節により一定に保たれていると考えられるが,皮膚の冷受容器であるTRPM8が,どの程度調節に関与しているのかは明らかではない。本研究では,TRPM8による芯部温の制御機構・及び体温調節応答について検討した。TRPM8のアゴニストであるメンソール塗布や低温暴露で引き起こされる芯部体温上昇が起こるが,この芯部体温上昇は,TRPM8ノックアウトマウスでは見られなかった。低温環境下での行動性・自律性体温上昇応答を調べたところ,TRPM8ノックアウトマウスでは,低温環境下での行動性体温調節は抑制されていた。低温環境下での末梢皮膚温度には変化がみられなかったが,低温環境への移行時の抹消皮膚温度低下応答がTRPM8ノックアウトマウスでは抑制されていた。以上のことからTRPM8は冷環境下での自律性・行動性体温調節応答に関与し,芯部体温を調節していることが示唆された。

 

(5) TRPM2 channelの単粒子解析による構造解明

丸山雄介1,小椋俊彦1,三尾和弘1,清中茂樹2,加藤賢太2,森 泰生2,佐藤主税1
1産業技術総合研究所 脳神経情報研究部門,
2京都大学大学院 工学研究科 合成生物化学)

 TRP(transient receptor potential) channel super family に属するTRPM2は,活性酸素種や温度を感知するチャンネルである。さらにADPRase酵素活性ドメイン(NUDT9-Hドメイン)を分子内に有し,このドメインへのリガンド結合によってもチャンネルの開閉が制御されるという極めてユニークなタンパク質である。我々はこのTRPM2タンパク質を精製し,電子顕微鏡画像を用いた単粒子解析法よりその三次元構造を解析した。分子全体はベル形構造をしており,大きく膨れた細胞質側ドメインが特徴的であった。膨らんだ構造は,我々が以前解析したTRPC3チャンネルでも保存されており,多種類の刺激のセンサーとして働くTRPチャンネル全体に共通なのかもしれない。またTRPM2チャンネルに特徴的な構造として細胞質端の中心部に大きな突起が見られた。この突起は角が丸い四角柱的な形状であり,TRPC3チャンネルがもつ中心がへこんだ小さな突起とは対照的である。四角柱的な形状の突起は,そのサイズから制御部位であるNUDT9-Hドメインの一部と考えられる。その位置は,膜貫通領域のイオンゲートとは遠く離れており,分子内での大掛りな立体構造変化の伝播が開閉を制御する可能性が示唆された。

 

(6) TRPV1チャネルの細胞外ナトリウムイオンによる活性調節

太田利男1,今川敏明2,伊藤茂男1
1北海道大学 大学院獣医学研究科 形態機能学講座,
2北海道大学 大学院先端生命科学院 先端細胞機能学)

 TRPV1は知覚神経細胞に発現し,capsaicin,熱,酸及び内因性バニロイドにより活性化されるポリモーダル侵害受容チャネルとして痛覚シグナル伝達に重要な役割を果たしている。近年,このチャネル活性が種々の陽イオンや浸透圧により調節を受けることが明らかにされている。我々は異所性に発現させたTRPV1チャネル及び知覚神経細胞を用いて,このチャネル活性が細胞外Naイオン([Na+]o)により強い活性制御を受けていることを見出したので報告する。

【方法】GFP融合ブタ及びヒトTRPV1遺伝子をHEK293細胞に一過性に発現させた。幼ブタ及び成熟マウス(wild及びTRPV1欠損 (TRPV1(-/-)) より背根神経節 (DRG) 細胞を分離培養した。TRPV1活性の測定はFura2を用いた細胞内Ca2+イメージング法及びホールセルパッチクランプ法による電流測定により行った。

【成績】TRPV1を発現したHEK293細胞を[Na+]o除去液(Na+をNMDG+に置換)に晒すと,細胞内Na濃度は低下したが,細胞内Ca2+濃度([Ca2+]i)は素早く増加し,この反応は[Na+]o除去の期間持続した。[Na+]o除去による[Ca2+]i増加反応はTRPV1アンタゴニスト(capsazepine, iodoresiniferatoxin,ruthenium red)により濃度依存性に抑制された。[Na+]oを他の一価陽イオンに置換した条件でも持続的な[Ca2+]i増加が生じ,これは細胞外Ca2+依存性であった。低[Na+]o条件(112mM)では,それ自身で著明な[Ca2+]i増加反応は起こさなかったが,低濃度のcapsaicin (30 nM),熱(46℃),酸(pH6.5)及び内因性バニロイド(15(s)HPETE,1mM)による[Ca2+]i増加反応を有意に増大させた。パッチクランプ法により膜電流と[Ca2+]iの同時測定を行ったところ,[Na+]o除去によりcapsaicin と同様な[Ca2+]i増加と外向き整流性の電流が生じた。酸感受性を担うアミノ酸を中性アミノ酸に置換したTRPV1変異体では,[Na+]o除去による[Ca2+]i増加反応は有意に減弱した。[Na+]o除去による[Ca2+]i増加や電流反応は初代培養ブタDRG細胞,マウスDRG細胞及びヒトTRPV1発現HEK293細胞においても見られたが,TRPV1欠損マウスのDRG細胞では生じなかった。以上の成績から,TRPV1チャネルは[Na+]oにより生理的な条件ではtonicな抑制を受けていること,またその作用部位には酸感受性ドメインが関与していることが示唆された。代謝性疾患の一つである低ナトリウム血症で生じる疼痛にこのような[Na+]oによるTRPV1調節の変調が関与している可能性が考えられる。

 

(7) TRPV2による細胞骨格・細胞運動の制御

小島 至,長澤雅裕,中川祐子(群馬大学 生体調節研究所細胞調節分野)

 TRPV2は小脳Purkinje細胞,肝・腎上皮細胞,膵内分泌細胞,消化管の神経内分泌細胞,肺・脾臓のマクロファージなどに高発現している。マクロファージでは,血清・fMLPなどの刺激によりPI-3キナーゼ依存的に細胞膜に移行し,持続的な細胞内カルシウムの上昇を生じる。細胞膜上のTRPV2局在を検討すると,TRPV2はfocal complexの特殊な形態であるポドソーム周辺に集積する。ポドゾームは細胞接着・遊走に重要な構造であるが,そこにはRho, Rac, Cdc42などの低分子量G蛋白,gelsolinなどのアクチン制御因子,Pyk2,srcなどのキナーゼなどが集積しTRPV2と共局在している。細胞膜直下のカルシウム濃度([Ca2+]pm)をモニターすると,ポドゾーム周辺で[Ca2+]pmが大きく増加している。TRPV2を抑制するruthenium redの投与やTRPV2ノック・ダウンによりポドゾーム近傍の[Ca2+]pm増加が消失することから,ポドゾーム近傍の[Ca2+]pm増加がTRPV2を介するCa2+流入に依存していることがわかる。ポドゾーム近傍の[Ca2+]pm増加によりカルシウム依存性キナーゼであるPyk2の活性化が予想されるが,実際Pyk2の燐酸化はTRPV2のノック・ダウンにより抑制される。またTRPV2のノック・ダウンによりポドゾームの数は大きく増加する。一方,Pyk2のdominant-negative変異体を導入するとポドゾームの数は大きく増加した。逆にionomycin投与によりCa2+流入を増加させるとポドゾーム数は激減する。以上の結果から,ポドゾームに集積したTRPV2を介するCa2+流入はPyk2を活性化し,これによりポドゾームを消失させると考えられる。TRPV2のポドソーム局在は,Ca2+流入増加・pyk2活性化を介してポドゾームのターンオーバーを制御し,これがマクロファージの接着,細胞運動に重要であると考えられる。

 

(8) 細胞間接着に依存した皮膚バリア機能におけるTRPV4チャネルの重要性

曽我部隆彰1,島貫恵実1,米村重信2,水野敦子3,富永真琴1,4,福見-富永知子1,4
1岡崎統合バイオサイエンスセンター(生理学研究所)細胞生理,
2理研 発生・再生科学総合研究センター,3自治医大 薬理学講座,
4総研大 生命科学専攻)

 皮膚,特に表皮は生体をシート状に覆い,外的環境との間にバリアを形成している。バリア機能は,さまざまな感染・侵入などをシャットアウトするだけでなく,体内からの水分蒸散を抑止して乾燥を防ぐ上でも非常に重要である。主たるバリア機能は最終分化した角質細胞(ケラチノサイト)とその間を埋める脂質多層構造から成る角化層が担っているが,その直下に存在する細胞間接着構造も,水分蒸散の調節に重要な役割を果たしている。細胞間接着構造(タイトジャンクション,アドヘレンスジャンクション)は,基底層から分裂したケラチノサイトが分化する過程でアクチンの再編成や細胞同士の重層化を介して形成され,その過程には細胞内外のカルシウム濃度上昇が重要であると言われている。しかしながら,ケラチノサイト内のカルシウム濃度上昇に関わる分子メカニズムや,カルシウム上昇が細胞間接着形成に果たす役割については,詳しく分かっていない。今回,我々は,ケラチノサイトに発現するカルシウム透過性のTRPV4チャネルが,細胞骨格再編成を介して細胞間接着構造依存的なバリア機能の形成に寄与していることを明らかにした。我々はまず,TRPV4に結合する因子としてbカテニンを見出し,TRPV4が細胞骨格と結合することを示した。野生型マウスとTRPV4欠損マウスのバリア機能を比較したところ,角質層依存的なバリアに違いはなかったが,細胞間接着依存的なバリアはTRPV4欠損マウス皮膚で有意な障害が見られた。培養TRPV4欠損ケラチノサイトにおいては,細胞外カルシウム添加によるアクチン再編成および重層化に明らかな遅滞が観察され,細胞間隙の透過性が野生型と比較して有意に上昇していた。さらに,この透過性上昇は,細胞間接着構造の異常に基づくことを見出した。生理的な皮膚温下におけるケラチノサイト内のカルシウム濃度は,TRPV4の欠損により有意に低下し,またアクチン骨格の破断によっても低下した。以上のように,本発表では,ケラチノサイトの温度感受性TRPV4チャネルが皮膚のバリア機能に果たすユニークな役割について報告する。

 

(9) Essential role of STIM1, ER calcium sensor,
for store-operated calcium influx and mast cell activation

馬場義裕,黒崎知博(大阪大学 免疫学フロンティア研究センター,
理研 免疫アレルギー科学総合研究センター)

 カルシウムシグナルは様々な生理的現象において重要な役割を担っているが,細胞内カルシウムの上昇は主に二つの経路から供給される。一つは細胞内カルシウムストアである小胞体からのカルシウム放出,もう一つは細胞膜上のチャネルを介した細胞外からのカルシウム流入である。免疫細胞の場合,細胞外からのカルシウム流入は小胞体のカルシウム枯渇が引き金となって引き起こされるカルシウム流入(ストア作動性カルシウム[Store-operated calcium: SOC]流入)が主要なソースとなり,長時間の持続的シグナルを維持する上で重要であると考えられている。細胞内カルシウムストアの枯渇が,いかなる分子機序でSOC流入を作動させるのかは長らく不明であったが,最近,小胞体カルシウムセンサーとしてSTIM1が同定され,SOCにおけるSTIM1の役割に関する知見が蓄積しつつある。我々は,STIM1遺伝子を欠損したDT40 B細胞株を用い,STIM1によるSOC活性化メカニズムの一端を明らかにしてきた。さらに,我々はSOC活性が強いとされるマスト細胞に着目し,STIM1ノックアウトマウスを用いて,SOC流入の生理的役割を検討した。マスト細胞はアレルギー反応を引き起こす主要エフェクター細胞であり,アレルゲンの刺激によって脱顆粒やサイトカイン産生を引き起こし,アナフィラキシー反応が誘導される。これらの現象におけるSOC流入の役割は不明であったが,本研究により,STIM1が誘導するカルシウム流入がマスト細胞を介したアレルギー反応に必須であることが明らかとなった。

 

(10) 毛様体筋収縮調節に関与する非選択性陽イオンチャネルと
TRPCチャネル

高井 章,宮津 基,安井文智(旭川医大 生理・自律機能分野)

【背景】視覚遠近調節を司る毛様体筋は副交感神経支配の平滑筋である。この特殊に分化した筋組織には,伝達物質(アセチルコリン)によるムスカリン受容体の刺激の続く限り一定の張力を保持し続ける特性があり,それが安定な焦点調節を可能にしている。昨年の本研究会でわれわれは,ウシ毛様体筋を用いた実験によりM3ムスカリン受容体刺激に応じて開講する2種類の非選択性陽イオンチャネル(NSCCL とNSCCS)が存在し,それらが持続的な筋収縮に必要な細胞外からのCa2+流入の主要経路として機能することを示す知見を報告した[1,2]。今回は,これらのnativeなチャネルの電気生理学的特性と,その活性化に関連する信号伝達経路について新たに得られた実験結果を報告する。また,この組織で同定された4 種類のTRPCとNSCCL/NSCCSとの関連を示唆する知見を提示する。

【方法】膜電位固定法による全細胞膜電流の記録,およびFluo-4蛍光法による細胞内Ca2+の記録には,酵素処理で単離したのち,fibronectin処理したガラス小円盤表面で短期間(1-5日)培養したウシ毛様体筋細胞を用いた。免疫染色には,培養細胞に低浸透圧下で超音波パルスを加えて細胞体を除去したあとガラス表面に付着したまま細胞内側を露出して残った細胞膜を用いた。

【結果と考察】単離細胞において,カルバコール(CCh; 0.5-2 mM)はNSCCL/NSCCS電流の活性化と,[Ca2+]iの上昇を起した。Gq/11阻害剤であるYM-254890 (YM; 3・10 mM)の細胞外投与により,それらの初期相,持続相とも完全に抑制された。一方,多くのTRPチャネルにも抑制効果を示すことで知られるLa3+,Gd3+およびSKF-96365は1-100mMの濃度範囲で持続相のみを濃度依存性に抑制した。TRPC6電流を増強することが報告されているfulfenamateは,10-100mMの濃度でNSCCL電流にも増強作用を示した。20mMのcaffeineの灌流により,NSCCSの開口によると見られる電流の可逆的活性化が観察された。この電流発生中に1-10mMのryanodineを加えるとcaffeine除去後も電流は減衰せずに持続した。NSCCSは,Ca2+枯渇に伴って活性化される経路により調節される可能性がある。免疫染色による実験では,細胞膜標本のaアクチン陽性領域に集中して,M3R,Gq/11,TRPC1,TRPC3,TRPC4およびTRPC6に特異的な抗体の結合を示す蛍光スポットが,いずれも1mm2以上という高密度で検出された[2,3]。また,抗IP3受容体(subtype 1)抗体により濃染される細胞内小胞体膜は,stromal interaction molecules subtype 1 (STIM1)に対する抗体によっても強く染色された。まだ検討すべき点は多いが,TRPCはNSCCL and/or NSCCSの有望な分子候補といえる。なお,NSCCS は,Ca2+枯渇に伴って活性化される経路により調節される可能性がある。

 

(11) 活性化アストロサイトにおけるTRPC3の生理的意義

白川久志,中尾賢治,杉下亜維子,中川貴之,金子周司
(京都大学 薬学研究科 生体機能解析)

 Astrocytes, one of the three principal types of brain glial cells in the CNS, are pathologically activated on intracerebral hemorrhage, which cause astrogliosis accompanied with abnormal morphology and excessive cell proliferation. Thrombin, one of the major blood-derived serine proteases, leaks into brain parenchyma when blood-brain barrier is disrupted. Besides its physiologically important role in blood coagulation, thrombin can induce brain injury and astrogliosis. Transient Receptor Potential Canonical (TRPC) channels are Ca2+-permeable, non-selective cation channels and activated by receptor stimulation or intracellular Ca2+ store depletion induced by IP3 receptor activation. Although TRPC channels have been reported to be expressed in astrocytes and involved in Ca2+ influx after receptor stimulation, their pathophysiological functions in reactive astrocytes remain to be elucidated. In this study, we focused on the pathophysiological role of TRPC in thrombin-activated primary cortical astrocytes. Twenty-four hour application of 1 U/ml thrombin induced significant TRPC3 up-regulation whereas TRPC1/6/7 expressions were less increased or not changed at all. TRPC3 up-regulation elicited by thrombin was time-dependent and mediated by stimulation of protease-activated receptor 1 (PAR1), one of the specific thrombin receptors, and required de novo protein synthesis. Pharmacological manipulations revealed that particular MAPKs cascades, i.e. ERK and JNK but not p38, and NF-kB signaling were involved in the process. Furthermore, Ca2+ signaling blockers, such as BAPTA-AM, cyclopiazonic acid, 2-aminoethoxydiphenyl borate and pyrazole-3, a selective TRPC3 inhibitor, attenuated TRPC3 up-regulation, suggesting that Ca2+ signaling including TRPC3 contributes to its up-regulation. Additionally thrombin induced the up-regulation of S100b, marker of reactive astrocytes, and cell proliferation, both of which was inhibited by the above Ca2+ signaling blockers. Specific knockdown of TRPC3 using siRNA also suppressed thrombin-induced S100b up-regulation, suggesting that TRPC3 contributes to astrocyte activation. In conclusion, these results suggest that thrombin evokes dynamical TRPC3 up-regulation, and that TRPC3 attributes to pathological activation of astrocytes accompanied with its up-regulation in a feed-forward induced expression mechanism. These findings are informative for elucidating the roles of TRPC3 in astrogliosis after intracerebral hemorrhage.

 

(12) 脊髄におけるシナプス前TRPA1チャネルの機能的意義について

中塚映政(佐賀大学 医学部生体構造機能学講座)

 TRPA1は後根神経節ニューロンにおいてTRPV1と共発現し,炎症による痛覚過敏や神経因性疼痛に関与していることが示唆されている。近年,末梢神経系におけるTRPA1の役割についての詳細な解析がなされてきたが,中枢神経系における関与は全く不明であった。今回,マスタードオイルの主成分で,TRPA1選択的作動薬であるallyl isothiocyanate (AITC)が,脊髄後角における興奮性シナプス伝達にどのような作用を及ぼすか調べた。実験は,成熟雄性ラットから作製した脊髄横断スライス標本の膠様質ニューロンにブラインド・ホールセル・パッチクランプ法を適用して行った。AITCの灌流投与によって,記録した約7割のニューロンで自発性興奮性シナプス後電流の振幅と発生頻度は有意に増加し,約半数のニューロンで内向き電流が誘起された。AITCによる自発性興奮性シナプス後電流の増強作用は非NMDA受容体阻害薬CNQX存在下あるいは無カルシウム溶液中では抑制されたが,tetrodotoxinやランタンによって影響を受けなかった。また,非特異的なTRPチャネル阻害薬であるruthenium redによって有意に抑制された。一方,AITCによって誘起される内向き電流はCNQXやtetrodotoxinに影響を受けなかったが,NMDA受容体阻害薬APVやruthenium red存在下では完全に阻害された。以上の結果から,TRPA1は膠様質ニューロンに入力する興奮性シナプス前終末に発現しており,その活性化に伴って,電位依存性カルシウムチャネルの開口なしにシナプス前終末へカルシウムが流入し,グルタミン酸含有シナプス小胞の開口分泌が誘発される。その結果,シナプス下膜のAMPA受容体のみならず,spill overしたグルタミン酸によってシナプス外のNMDA受容体が活性化され,膠様質ニューロンにおける興奮性シナプス伝達は増強することが明らかとなった。中枢神経系におけるTRPA1の内因性リガンドは未だ不明であるが,細胞内で上昇したカルシウムがTRPA1を活性化すると報告されている。これらのことから,脊髄後角におけるシナプス前TRPA1の活性化は,生理的な痛みの調節あるいは病態時の難治性疼痛に関与している可能性が示唆された。

 

(13) TRPV4の活性化を介したアストロサイトの興奮:
神経-グリア機能連関の解明

柴崎貢志1,2,3,富永真琴1,2,31岡崎統合バイオサイエンスセンター 細胞生理研究部門,
2生理学研究所 細胞生理研究部門,
3総合研究大学院大学 生命科学研究科 生理科学専攻)

 我々は温度感受性TRPチャネルに属するTRPV4(活性化温度閾値: 34℃以上)が海馬に高発現しており,体温を介して海馬神経細胞の興奮性を向上させていることを見いだした(Shibasaki et al. J. Neurosci., 2007)。脳組織標本を詳しく解析したところ,神経細胞の他,アストロサイトにもTRPV4発現を認めた。非常に興味深いことに,アストロサイトのマーカーであるグリア酸性繊維性蛋白質(GFAP)に陽性のアストロサイトの中に,TRPV4陽性と陰性の二種類の細胞が存在していた。この結果は,TRPV4の発現を指標にアストロサイトのサブクラスを分類できる可能性を示唆している。次に,アストロサイトに機能的なTRPV4チャネルが発現しているのかをFura-2を用いたカルシウムイメージング法で確認したところ,TRPV4のmRNAや蛋白質発現と一致し,ある特定のアストロサイトのみがTRPV4の特異的アゴニスト(4a-PDD)に対する応答性を示した。さらには,このごく一部のTRPV4陽性アストロサイトの興奮に引き続き,周囲のアストロサイトに激しいカルシウム波が引き起こされることを観察した。つまり,TRPV4陽性アストロサイトはTRPV4の活性化に伴い,何らかの情報伝達物質を遊離し,周りのアストロサイトに興奮を伝播している可能性が示唆された。そこで,ホールセルパッチクランプ法を応用したバイオセンサー法を用いて,その伝達物質を同定した。このようなアストロサイトからの情報伝達物質の遊離は,アストロサイトTRPV4の活性化→周囲のアストロサイトの興奮→神経細胞の興奮/抑制というカスケードが存在する可能性を強く示唆しており,神経-グリアの機能連関を調べるのにTRPV4が非常に有用なツールであることを強く示唆している。

 

(14) PKCg によるTRPC3の制御の異常と脊髄小脳変性症(SCA14)
発症の関係について

齋藤尚亮(神戸大学 バイオシグナル研究センター)

 プロテインキナーゼC (PKC)は,活性化時に細胞膜にトランスロケーションすることが知られている。我々はこのトランスロケーションをPKCの活性化の指標として,どのPKCサブタイプが,「いつ」「どこで」「どのようにして」活性化されるのかを解析してきた。コンフォーカルレーザー顕微鏡下での観察によって,PKCのトランスロケーションはサブタイプによりあるいは細胞刺激によって異なっていることが明らかとなった。さらに,全反射顕微鏡を用いたPKCの1分子観察により,PKC各分子が短い時間(1秒以下)の細胞膜との結合を繰り返すことにより,数分間のPKCトランスロケーションを形成していることがわかった。脊髄小脳変性症(SCA)14型はPKCg のアミノ酸変異によって引き起こされる優勢遺伝型の神経変性症である。我々はこれらの変異が,このPKCのターゲティング部位,膜結合時間,活性に着目し,これらの異常がどのような生理機能に影響を及ぼすのかを解析した。野生型PKCg 発現細胞では,非発現細胞に比べ,細胞刺激による細胞外からのCa2+流入を速やかに終了させるのに対して,SCA14変異体では延長したままであった。このCa2+流入にはTRPCチャネルが関与しており,TRPC3チャネルは野生型PKCg によってin vitroにおいてリン酸化を受け,抑制されることが分かった。しかし,SCA14変異体はin vitro活性測定において高い酵素活性能を有したにもかかわらず,in vivoではTPRC3をリン酸化しなかった。全反射顕微鏡を用いて,PKCg の一分子における細胞質膜上での動態を観察したところ,変異体の膜滞在時間が野生型に比べて有意に短縮していることを見出した。これらの結果より,in vitroで高い活性を示すものであっても,十分な膜滞在時間を伴ったトランスロケーションを持たない変異PKCでは,基質である膜蛋白質のリン酸化ができず,細胞機能調節が行えないことを示唆しており,生化学的には説明のつかなかった疾患発症メカニズムをイメージングにより始めて可能にした。

 

(15) エンドセリンA型受容体を介したCa2+シグナリングの多様性と
TRPCチャネル

堀之内孝広,三宅由美恵,西屋 禎,西本 新,三輪聡一
(北海道大学大学院 医学研究科細胞薬理学分野)

 エンドセリンA型受容体(ETAR)は,Gq・Gs・G12タンパク質と共役していることが知られている。私達は,以前に,ETARを介して引き起こされる持続性の細胞内Ca2+濃度([Ca2+]i)上昇反応に,Gq・G12タンパク質やTRPCチャネルが関与していることを報告した。しかしながら,ETAR刺激によるGq・G12タンパク質の活性化からTRPCを介した持続性Ca2+流入へ至る一連のシグナルカスケードについては,不明な点が多い。本研究では,ETARを介して活性化されるCa2+シグナリングの多様性を解明するため,ETAR発現レベルが異なる2種類のCHO細胞(ETAR高発現 : 32,000 fmol/mg protein (ETAR-H)及び低発現:900 fmol/mg protein (ETAR-L))を作製し,これらのクローンにおけるETARシグナリングを,Ca2+測定実験,CytosensorTM microphysiometerを用いた酸排出速度測定実験及びWestern blot法によるp38MAPKのリン酸化量測定実験により,詳細に解析した。また,ETAR及びTRPCを安定発現するHEK293を用いて,ETARを介したCa2+シグナリングにおけるTRPCの機能的重要性について検討した。ETA R-Hにおいて,ET-1は,一過性及び持続性の[Ca2+]i上昇反応を引き起こした。一方,ETAR-の場合,ET-1刺激により,ETAR-Hと同レベルの一過性[Ca2+]i上昇反応が生じたものの,持続的なCa2+流入は認められなかった。ETAR-Hにおいて活性化されるシグナル分子を解析したところ,(1)Gq→PLC→TRPC,及び,(2)G12→p38MAPK→TRPC及びNa+/H+ exchanger (NHE),という2種類のシグナルカスケードが,持続性の[Ca2+]i上昇反応に必須であることが示された。一方,ETAR-Lの場合,Gq→PLC→p38MAPK→NHEという経路が活性化されるため,持続的なCa2+流入が生じないと考えられた。これらの知見は,細胞膜における受容体の発現レベルが,ETARを介したCa2+シグナリングに多様性を持たせていることを示唆している。次に,ETARを介したCa2+シグナリングを修飾するTRPCを同定するため,ETAR及びTRPCを安定発現するHEK293を用いて解析を行った。その結果,細胞外Ca2+を除去した条件下で引き起こされるET-1によるCa2+ストアからのCa2+の遊離及びその後のCa2+添加により生じる細胞外Ca2+流入は,TRPC1・3・4・5・7を共発現させることにより,増強された。また,このうち一部のTRPCは,ETARと共沈降することが確認された。これらの知見から,TRPCが直接もしくは,何らかのアダプター分子を介してETARと相互作用することにより,受容体作動性に誘発されるCa2+ストアからのCa2+の遊離や細胞外Ca2+流入を増強していると考えられた。

 

(16) Snapinをアダプターとする受容体作動性Ca2+流入機構

鈴木史子,森島 繁,田中高志,村松郁延(福井大学 医学部 薬理学領域)

 われわれは,yeast two-hybrid法を用いて,SNARE complex関連タンパクであるSnapinが,a1Aアドレナリン受容体と相互作用することを発見した。また,Snapinが共発現する細胞では受容体作動性Ca2+(ROC)流入が増強されることや,逆にRNAi法にて内因性のSnapinをノックダウンすると細胞外からのROC流入が著しく減少することを明らかにした。このSnapinを介するROC流入機構の分子機構を詳細に明らかにすることを目標として,Snapinと受容体やイオンチャネルの相互作用がどのようにして起こるかを調べた。まず,我々は,免疫沈降法にて,Snapinは,a1A受容体のほかにも,ROCチャネルとして知られるTRPC6とも相互作用することを明らかにした。また,a1A受容体を活性化すると,a1A受容体-Snapin-TRPC6複合体が形成され,TRPC6が表面細胞膜にリクルートされることも明らかになった。さらに,BiFC (bimolecular fluorescent complementation)法により,Snapin同士はそれぞれのアミノ基側同士を介して,2量体を形成することが明らかになった。このことから,a1A受容体活性化により形成されるa1A受容体-Snapin-TRPC6複合体は,a1A受容体-SnapinとSnapin-TRPC6がSnapin同士の結合によって,その形成が促進されることが明らかになった。Snapinと結合する膜蛋白には様々なものが知られているが,これらの実験結果より,Snapinに結合するタンパク同士が,Snapinの2量体形成を介して,相互に結合する可能性が示唆された。

 

(17) 副腎髄質細胞におけるCa流入経路とTRPCチャネル

井上真澄(産業医科大学 医学部第2生理学)

 ラット副腎髄質細胞にSERCA pump抑制薬のcyclopiazoic acid (CPA)を投与すると,細胞外Ca2+依存性に細胞内Ca2+濃度が持続的に上昇した。この上昇は1mM Ni2+により完全に抑制されたが,100 mM D600ではわずかしか抑制されなかった。一方,40mM K+により誘発されるCa2+濃度の上昇はD600により約80%抑制された。穿孔パッチクランプ法により-50mVで全細胞電流を記録すると,1mM Ni2+により見かけ上外向き電流が誘発されたが,D600では誘発されなかった。Ni2+誘発性外向き電流は保持電位が過分極するに従い減少した。CPAは保持電位-50 mVでの全細胞電流,及びNi2+誘発性外向き電流に影響を及ぼさなかった。膜電位固定化にcaffeineにより細胞内Ca2+貯蔵部位を枯渇させても,caffeine washout後に内向き電流は発生しなかった。Caffeineによる細胞内Ca2+動員は,caffeine washout後のNi2+の投与により抑制された。副腎髄質には,mRNAと蛋白レベルでTRPC1, TRPC5とTRPC6が発現していた。副腎髄質細胞におけるTRPC1様免疫反応物の分布は,主に小胞体マーカーのBODIPY-thapsigargin結合部位と一致した。Stim1の発現は,イムノブロット法及び免疫細胞化学法によりほとんど確認されなかった。これらの結果は,ラット副腎髄質細胞には貯蔵部位作動性Ca2+流入機序は存在しないこと,そしてTRPC1チャネルの大部分は小胞体に存在し細胞膜には分布しないことを示唆している。

 

(18) Counteracting effect of TRPC1-associated store-operated Ca2+ influx on TNFa induced COX2-dependent PGE2 production in human colonic myofibroblasts

Hai Lin, Yasuhiro Kawarabayashi, Akira Honda, Ryuji Inoue
(Department of Physiology, Graduate School of Medical Sciences, Fukuoka University)

 Most attention in inflammatory bowel disease (IBD) has focused on an proinflammatory cytokine TNFa, and its functionally effective antibodies which are an important therapeutic innovation in recent years. One major cellular consequences of TNFa's action is increased release of prostaglandin E2 (PGE2) via induction of cyclooxygenase-2 (COX2) in myofibroblasts, which contribute to inflammatory and neoplastic processes in the gastrointestinal tract. Part of the PGE2 release from myofibroblast has been shown to be dependent on Ca2+, but what source contributes thereto remains entirely unclear. In this study, we therefore explored the potential role of transient receptor potential (TRPC) proteins for this process by evaluating their expression profiles and functions in the human colonic myofibroblast cell line CCD-18℃. Treatment with TNFa of CCD-18℃ greatly enhanced store dependent Ca2+ influx with increased expression of TRPC1 (but not the other TRPC isoforms) and also of COX2 (but not COX1) with subsequent increase in PGE2 secretion. These consequences occurred dose- and time-dependently, becoming significant several hours after TNFa treatment. Selective inhibition of TRPC1 expression by small interfering RNA (siRNA) targeting TRPC1 antagonized the enhancement of the Ca2+ influx by TNFa, but conversely potentiated the TNFa-induced PGE2 secretion from CCD-18℃. In contrast, overexpression of TRPC1 in CCD-18℃ produced the opposite consequences. Inhibitors of Ca2+-dependent transcitprion factor NF k B attenuated PGE2 production enhanced by TNFa, whereas inhibition of another Ca2+-dependent transcription factor NFAT, further upregulated PGE2 production by TNFa. These results at least suggest that, in colonic myofibroblast cells, TNFa mediated up-regulation of TRPC1 negatively regulates PGE2 synthesis through NFAT activation.

 

(19) 心筋細胞におけるP2Y受容体-TRPC5機能的共役の意義

西田基宏(九州大学大学院 薬学研究院薬効安全性学分野)

 様々な神経体液性因子による心筋細胞の肥大応答において,Ca2+-NFATシグナリング経路が極めて重要な役割を果たすと考えられている。ノルアドレナリン・アンジオテンシン(Ang) II・エンドセリン(ET-1)といった血管収縮性物質だけでなく,細胞外ヌクレオチド(ATP)もまた細胞内Ca2+シグナリングを活性化することが知られている。ATPは,Gq蛋白質共役型(P2Y)受容体を介してNFATを活性化する。しかしながら,ATP刺激によって心肥大は誘導されない。このことは,ATPがNFAT経路だけでなく,心肥大を抑制するシグナル経路も活性化する可能性を示している。我々は以前,Ang IIやET-1刺激による心肥大応答において,ジアシルグリセロール (DAG)感受性TRPチャネル(TRPC3/TRPC6)が関与することを報告した。また最近,TRPC6チャネルの活性化が8-Br-cGMPやホスホジエステラーゼtype V(PDE-V)阻害剤によって抑制されることを見出している。そこで本研究では,ATP刺激による細胞内Ca2+濃度上昇がNO-cGMP-PKG経路を活性化することで心肥大を抑制するのではないかという仮説を立てたATP刺激はET-1やAng II刺激よりも強くNFATを活性化したが,心肥大の指標であるBNP転写活性やタンパク合成を上昇させなかった。しかし,NO合成酵素阻害剤(L-NAME)を前処置しておくと,ATP刺激によりBNP転写活性は増加した。ATP刺激は,ET-1やAngII刺激よりも強くNO産生を惹起した。ATP刺激によるNO産生は,IP3受容体阻害剤(xestospongin C)やTRPC5 siRNA処置によって抑制され,TRPC6 siRNA処置では抑制されなかった。さらに,TRPC5 siRNAを処置した心筋細胞において,ATP刺激はBNP転写活性を有意に増加させた。ATP刺激によるNFAT活性化は,TRPC5 siRNAおよびTRPC6 siRNA処置によりそれぞれ部分的に抑制された。以上の結果から,ATP刺激によるCa2+シグナリングの活性化には,IP3-TRPC5経路とDAG-TRPC3/TRPC6経路の2つが関与すること,およびIP3経路を介したNO-cGMP-PKG経路の活性化が,TRPC3/TRPC6を介した心肥大シグナリングに対して抑制的に働くことを明らかにした。ATPは,機械的圧負荷や虚血によって細胞内から細胞外へと遊離される。P2Y受容体-TRPC5チャネルの機能的共役は,病的ストレスにより生じる過剰なCa2+シグナリングに対する負の制御機構として働いているのかもしれない。

 



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