大脳皮質の局所神経回路構築を解析する上で、各種神経細胞上にどれほどのシナプス結合があるかを解析する事は非常に大事な事である。その解析方法として、連続超薄切切片を電子顕微鏡を使って観察し、神経組織を３次元再構築し解析する方法が考えられる。私達は、この方法を使い、これまで、多くの神経細胞を解析してきたが、下記の２つの問題点に気がついた。１）超薄切切片の厚みの正確な測定が、３次元再構築像の質を大きく左右する。２）切片面に平行あるいは平行に近い角度に存在するクレフト面を持つシナプス結合は、従来のシナプス結合の定義による観察では見逃してしまう為、本来のシナプス入力の密度よりもかなり少ないシナプス数しか探知出来ない。これら２つの問題点を改善する為に下記の方法を今回報告した。まず、超薄切切片の厚み測定方法であるが、従来、minimal folding法、干渉光測定法、ミトコンドリアを利用した推測法が使われて来たが、いずれも、必ずしも正確な厚みを測定する方法とは言えない。私達は、1nmの解像度を持つカラー３Dレーザ顕微鏡を使って超薄切切片の厚みを測定し、信頼できる測定が可能である事を確認した。次に、シナプス結合の同定に関して、切片面に平行あるいは平行に近い角度のクレフト面を持つシナプス結合は、連続切片で、従来のシナプス結合の同定の為の定義の順序通りにシナプス要素が観察できる場合はシナプス結合と判断して良い事を、tomography解析等により見出した。シナプス確認の為の新しいこの方法を使って、parvalbumin陽性樹状突起表面に入力するシナプスの数を測定した所、およそ１／３から半分程度のシナプスを新たに確認する事ができた。この事は、旧来のシナプス同定法だけを使った場合、シナプスの多くを見落としてしまう事を示している。今後は、この新しい方法を使った、神経回路構築の定量的解析が望まれる所である。
Kubota Y, Hatada S, Kawaguchi Y (2009)
Important factors for the three-dimensional reconstruction of neuronal structures from serial ultrathin sections
Frontiers in Neural Circuits, Volume 3, Article 4
(A, D) 切片面に平行あるいは平行に近い角度のクレフト面を持つシナプス結合を連続切片（７０nm）でとらえた電子顕微鏡像。従来のシナプス結合の同定の為の定義の順序通りにシナプス要素が観察できる。 (A) 前神経終末にはシナプス小包が多く存在する（星印） (B) 前神経終末格子 (C) シナプス後膜肥厚（PSD） (D) シナプス後樹状突起の細胞質 (E, F) 左の連続写真から作成したパルブアルブミン陽性樹状突起（黄色）とそれにシナプス接着しているGABA陽性神経終末（赤色）GABA陰性神経終末（青色）パルブアルブミン陽性神経終末（桃色）(E) 従来のシナプス同定方法で確認できたシナプス神経終末。手前正面にはシナプス神経終末が分布していないのがわかる。 (F) 本研究で提唱した新しい同定方法で確認できたシナプス神経終末を加えて再構築した像。樹状突起の表面全体が神経終末で覆われているのがわかる。
Quantitative analysis of anatomical synaptic connectivity in microcircuits depends upon accurate 3-dimentional reconstructions of synaptic ultrastructure using electron microscopy of serial ultrathin sections. Here we address two pitfalls in current methodology that lead to inaccurate reconstructions and compromise conclusions drawn from the data. The first pitfall is inaccurate determination of ultrathin section thickness, which negatively affects the three-dimensional shape of reconstructions and therefore impairs quantitative measurement of synaptic structures. Secondly, current methodology significantly underestimates the number of synaptic junctions, with only two-thirds or less of genuine synaptic contacts being identified in dendrites that radiate within the plane of section. Here we propose a new methodology utilizing precise optical measurements of section thickness and successive observations of synaptic elements across serial ultrathin sections that corrects for these limitations to allow accurate 3-dimentional reconstruction of synaptic ultrastructure. We use this methodology to reveal that parvalbumin (PV)-expressing cortical interneurons have a much higher synaptic density than previously shown. This result suggests that this technique will be useful for re-examining synaptic connectivity of other cell types.
