我々は、これまでに、細胞外ATP によって活性化されるP2X2チャネルが、分子内に膜電位センサー領域を有しないのに、膜電位とATP に依存するゲートを示すことを明らかにしてきた。本研究では、膜電位に依存するゲートステップの一次構造上の基盤を明らかにすることを目的として、変異体解析を行った。(1) まず、ATP結合部位と同定されている領域の変異体の解析を行ったところ、K308Rでは、電荷が保存されているにも関わらず、コンダクタンス-膜電位関係が過分極側に大きくシフトしており、また、活性化速度が速かった。この性質は、ATP結合ステップと膜電位依存的ゲートステップからなる3ステートモデルにおいて、ゲートステップのkoffを増加させることによりシミュレートできた。(2) 次に、ATPによる活性化に関与することが知られている膜貫通部位の細胞外側端に位置するアミノ酸残基の変異体の解析を行った。T339S等は、低いATP濃度では遅い膜電位依存的活性化を示し、高いATP濃度では、膜電位に依存しない恒常的活性化を示した。この性質は、3ステートモデルにおいて、ゲートステップのkoffを減少させることによりシミュレートできた。(3) koff に逆向きの変化を与えたK308RとT339Sの2重変異体の解析を行ったところ、野生型P2X2に極めて近い性質を示した。以上の実験結果は、ATP受容体チャネルP2X2の膜電位依存的ゲートに、ATPとATP結合部位の複合体と、膜貫通部位細胞外側端が寄与していることを示す。ATP- ATP結合部位複合体がリンカー部分を経由して膜貫通部位細胞外側端に間接的に作用し、ゲート開口につながる膜電位依存的な構造変化をトリガーすることが示唆された。

論文情報

Batu Keceli and Yoshihiro Kubo
Functional and structural identification of amino acid residues of the P2X2 receptor channel critical for the voltage- and [ATP]-dependent gating.
Journal of Physiology 587: 5801-5818 (2009)

【 図 】 変異体解析により同定した膜電位依存的ゲートに重要なアミノ酸残基

Zebra fish P2X4 の結晶構造 (Kawate et al. (2009)) に基づいたhomology modeling による rat P2X2の構造上にマップした。

Ａ：側面図

変異体解析により同定した、ATP 結合部位近辺に位置し、膜電位依存的ゲートに重要なアミノ酸残基を示した。

Ｂ：膜貫通部位を細胞外側から観察した図

膜貫通部位の細胞外側よりに位置し、膜電位依存的ゲートに重要なアミノ酸残基を示した。

青斑核に存在するノルアドレナリン神経細胞は、覚醒や痛みの制御などさまざまな役割を担っています。甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(Thyrotropin-releasing hormone：TRH）は視床下部で発見された神経ペプチドで、覚醒レベルの上昇や、痛み伝達の抑制などの作用があることが知られています。しかし、これらのTRHの作用機序は十分には明らかになっていませんでした。そこで今回私達は、ラットの青斑核から急性単離したノルアドレナリン神経細胞にパッチクランプ法を適用して、TRHの作用とそのメカニズムを検討しました。

青斑核ノルアドレナリン神経細胞は、単離した後も自発的な活動電位を発生しており、この単離神経細胞にTRHを投与したところ、TRHは活動電位の発生頻度を増加させました。種々の薬理学的ツールを用いた検討から、TRHのノルアドレナリン神経細胞に対する興奮作用は、TRHがホスホリパーゼC（PLC)を介してPIP2を加水分解し、その結果として、細胞膜中のPIP2 濃度が下がって、カリウムチャネルが閉じることが原因となっていることがわかりました。

ノルアドレナリン神経系は様々な生理的役割を担っていることから、TRHは青斑核ノルアドレナリン神経系を介して様々な中枢神経系の機能に影響を与えていると考えられます。

論文情報

Ishibashi H, Nakahata Y, Eto K, Nabekura J.
Excitation of locus coeruleus noradrenergic neurons by thyrotropin-releasing hormone.
J Physiol. 2009 Dec 1;587(Pt 23):5709-22.

【 図1 】

（A）単離した青斑核ノルアドレナリン神経細胞。
（B) TRH による活動電位の発生頻度増加。
（C）細胞内シグナルメカニズム。TRHはホスホリパーゼC（PLC）を活性化することによりPIP2を分解する。細胞膜中のPIP2 濃度の減少によってカリウムチャネルが閉じて細胞膜が脱分極する。

視覚グルーピングは視覚対象の検出に重要な働きをしている。視覚グルーピングとは視野上の複数の離散的要素をつなぎ合わせて一つのまとまった群として捕らえることである。例えば、同じコントラストのドットが連続的に並んでいると、ドットがつなぎ合わされて線として知覚される（図１Ａ）。このつなぎ合わせは点と点の空間的な配置や類似性、つまり図に含まれる要素間の関係に基づいて生じる。また、グルーピングは過去の経験や知識などのトップダウンのメカニズムも働くことが知られている（図１Ｂ）。しかしながら、トップダウン的なグルーピングがどのような神経メカニズムによって生じているのかはわかっていない。そのことを明らかにするために、グルーピングを必要とする課題をサルに行わせ神経活動の記録を行った。

複数のドットによって構成される視覚刺激をコンピュータディスプレイ上に呈示し、サルに視覚刺激の弁別を行わせた。視覚刺激は空間的に離れて配置する白または黒の５つの正方形ドットが十字に配置して構成される（図２Ａ）。ドットのコントラストの組み合わせによって20種類の視覚刺激を作成し、同じコントラストのドットが縦または横に一直線に並ぶパターンをターゲット刺激、それ以外をノンターゲット刺激とした。サルは１試行中に連続的に提示される視覚刺激からターゲット刺激を検出する（図２Ｂ）。さらに、この課題ではどの向きのターゲット刺激が呈示される確率が高いかをあらかじめ手がかりとして与えておき、サルがターゲット刺激の特定の向きに注意を向けるように操作した。

課題遂行中のサルの頭頂間溝皮質の外側壁（L-IPS）から１０７個の神経細胞の活動を記録した。図３に記録したニューロンの代表例を示す。このニューロンは、同じコントラストのドットが横に並ぶターゲット刺激に対して強く応答したが、縦に並ぶターゲット刺激に対してはほとんど反応を示さず、ターゲット刺激の向きについて選択的な反応を示した（図３Ａ，Ｂ）。この向きに選択的な反応は視覚刺激の局所的なコントラストの差によっては説明できず、複数のドットがつなぎ合わされることによって作られた視覚特徴に対してこのニューロンが選択的に反応していることを示している。向きに選択的な反応は注意を向けている条件（赤色）と注意を向けていない条件（青色）の両方で見られたが、注意の条件間で反応を比較すると、注意を向けている条件下（赤色）ではターゲットの向きによる差がより大きくなることが分かった（図３Ａ，Ｃ）。さらに、L-IPSのニューロン活動はサルの行動パフォーマンスと相関していた。このような反応特性は記録したL-IPSのニューロン集団においても共通に見られた。

これらの結果は、L-IPSのニューロンがグルーピングされた視覚対象を選択的に表現し、その表現がトップダウン的な注意を向けることによって強められることを示している。このことはL-IPSのニューロン群がトップダウン的な注意の影響を受けるグルーピングに重要な働きをしていることを示す。

【図１】 

Ａ：要素間の関係によって生じるグルーピング
空間的に離れて位置する白い四角と黒い四角は１つのまとまりとして捉えられ、それによって縦線が知覚される。
Ｂ：知識や経験に基づくグルーピング
風景の中にキリンが隠れている。キリンを見つける前は空間的に離れている点は背景の一部を構成しているが、キリンを見つけた瞬間それまで背景を構成していた点がキリンを構成する要素としてつなぎ合わされる。このつなぎ合わせはキリンについての知識（長い首、長い足、まだら模様など）によって促進される。
（このページの最後に元画像を載せています）　

【図２】 

Ａ：実験に用いた２０種類の視覚刺激
各刺激は白または黒の５つのドットが十字に配置して構成される。□または■が横または縦に並んだパターンがターゲット刺激、それ以外はノンターゲット刺激。
Ｂ：１試行のタイムコース
視覚刺激は短い時間間隔で連続的に呈示される。ターゲット刺激が呈示されたときにレバーを放すことで報酬が得られる。

【図３】 

Ａ:４つのグラフはそれぞれターゲット刺激への神経応答の時間変動を示している。縦軸は記録したニューロンの発火頻度（１秒間のスパイク数）、横軸はターゲット刺激が提示されてからの時間を示す。各グラフの下段の黒いバーがターゲット刺激の呈示期間を表す。
Ｂ:それぞれの刺激に対する平均発火頻度。刺激呈示後50ミリ秒から250ミリ秒の期間で計算した。
Ｃ：ターゲットの向きに対する選択性の強さ。縦に並ぶターゲット刺激に対する反応の平均と横に並ぶターゲット刺激の反応。右側の棒の長さはそれらの差分を示し、向きに対する選択性の強さを表す。 注意が向けられている条件での反応は'赤色'、注意が向いていない条件での反応は'青色'で表す。

 東山動植物園のキリン（元画像）

大脳腹側の高次領野は色を知覚する上で極めて重要な役割を果たしていると考えられています。大脳皮質の腹側の領域が損傷されると色が知覚されなくなる大脳性色覚異常とよばれる症状が起きるからです。しかし大脳の腹側にどのような皮質領野が存在し、その部位のニューロンのどのような働きで色が知覚されているのかについてはまだよく分かっていません。私たちは大脳高次領野で色情報がどのように処理されているかを調べる研究を行っています。図１はサルの大脳皮質と色情報処理に関係する経路を示しています。下側頭皮質は大脳皮質の腹側に存在する高次領野で、損傷されると色の識別が障害されるのでヒトで色知覚に重要な役割を果たす腹側高次視覚領野と対応するものと考えられます。今回の研究で私たちは下側頭皮質後部（PIT)でニューロンの刺激選択特性を詳細にマッピングした結果、鋭い色選択性を持つ細胞が密集して存在し、視野の場所を表現する地図を持つ領域が存在することを発見しPITC（下側頭皮質後部色領域）と名づけました。この領域は色情報処理に深く関係しているものと考えられます。

図２Aは今回マッピングを行ったPITの場所を示しています。この場所は下側頭皮質の入口にあたる場所です。図２Bは脳の写真の上に我々が新しく発見したPITCの位置を示しています。PITCは後中側頭溝（PMTS)をまたがって存在し、上部のニューロンは中心視野に受容野を持ちますが、下部に移動すると受容野は周辺視野を含むようになり、更に後部では上視野、前部では下視野に受容野を持つという、全体として大ざっぱな視野の地図を持っていました。大脳視覚野にはいくつもの視野の地図が存在しますが、別々の視野地図は別々の機能に対応すると考えられています。従ってPITCも特定の機能に関係した一つの領野に対応するものと考えられます。この領域に鋭い色選択性を持つニューロンが多いことから、PITCは色情報処理に深く関係した領野であると推測される訳です。

図３にはPITCとその周辺で記録されたいくつかのニューロンの色選択性を示しています。左下に示したように、CIE-ｘｙ色度図で一定間隔に分布した同じ明るさ（輝度）の色刺激のセットを使って、ニューロンの反応を調べました。PITC内に示した４つのニューロンはいずれも鋭い色選択性を持っています。一方、PITCの外で記録された２つのニューロンは鋭い選択性を示しませんでした。

図４はPITCとその周りの領域のニューロンの性質をマッピングした結果を示します。図４Aは色選択性の鋭さを示しています。SとBはそれぞれ一定の定量的な基準を上回る鋭い色選択性を示した細胞と（S)と示さなかった細胞（B)を示しています。点線より下の領域にSのニューロンが密集して存在していました。図４Bは受容野が視野のどこに位置していたかを示しています。上の方には中心視野に受容野を持つ細胞（F)が多いのに対し、下の方ではより周辺視野を含む受容野を持ち、更に上視野に受容野を持つ細胞（○）が後に存在し、下視野に受容野を持つ細胞（●）が前の方に存在し、全体として大ざっぱな視野地図を持っていることが分かります。

今回の発見は、大脳高次領野における色情報処理の仕組みの一端を明らかにしたものです。この領域のニューロン活動が色知覚の成立とどのように関わっているのかを知ることは今後の課題です。

論文情報

Yasuda M, Banno T and Komatsu H
Color Selectivity of Neurons in the Posterior Inferior Temporal Cortex of the Macaque Monkey.
Cerebral Cortex, doi: 10.1093/cercor/bhp227, 2009

【図１】 

色の情報は目の網膜にある三種類の錐体細胞が違う波長の光に違う応答をすることに起源があります。錐体の応答の差を検出する網膜の細胞が色の情報を大脳一次視覚野（V1)に伝えます。大脳に入った色の情報は、V1からV2野、V4野を経て下側頭皮質に伝えられます。

【図２】 

Aは今回マッピングを行った下側頭皮質後部（PIT)の場所を示しています。PITは２本の破線で挟まれた領域です。赤の部分の脳の絵をBに示します。Bには今回発見したPITCの場所と視野地図を模式的に示します。図中の略号はAは前、Pは後、Dは上、Vは下を表します。IOS＝下後頭溝、LS＝月状溝、PMTS=後中側頭溝、STS＝上側頭溝

【図３】 

PITCとその外で記録されたニューロンの色選択性の例を示しています。SとBはそれぞれ一定の定量的な基準を上回る鋭い色選択性を示した細胞と（S)と示さなかった細胞（B)です。赤線で囲まれた場所がPITCです。左下はCIE-ｘｙ色度図で、色付の円は実験で使った色刺激の色度座標を示しています。どの座標がどのような色に対応するかを分かりやすく示すために円に実際に近い色をつけています。実験の時には正確に色度と輝度をキャリブレーションした刺激を使います。６個のニューロンの色選択性は、十字で示した色度の色刺激に対するニューロンの応答を円の直径で示しています。Sで示したニューロンは青、紫、赤紫などに鋭い色選択性を持っています。実線は太いものから順に最大応答の８０％、６０％、４０％、２０％の場所を示す反応等高線です。

【図４】 

１頭のサルのPITでニューロンの色選択性と受容野をマッピングした結果を示します。内容については本文を参照してください。AとBいずれにおいても左上の点線より下の領域がPITCとして同定した領域です。中央やや下にある右下がりの実線はPMTSの位置を示しています。

多くの神経細胞同士は、1 µm²以下のごく小さい面（シナプス接合部）を介して、信号の受け渡しを行なっている。これまで我々の研究室では、急速に凍結した脳組織標本を割断することで、シナプス接合部をあらわにし、受容体に対する免疫抗体標識を行ない、これを電子顕微鏡で観察することで、シナプスにおける受容体の多様な二次元分布様式を明らかにしてきた。

本研究では、外側膝状体中継細胞へのシナプスに注目した。この細胞は、網膜からの強力なシナプス入力を受け取り、受け取った信号を大脳皮質へ伝えるとともに、大脳皮質からは微弱なフィードバック・シナプス入力を受け取ることが知られている。網膜からのシナプス入力（RGシナプス）、および皮質からのシナプス入力（CGシナプス）は、ともに、グルタミン酸作動性であるが、同じ細胞へのこの二種類のシナプス間で、個々のシナプスの面積や受容体分布パターンが全く異なることが明らかになった。要約すると、１）シナプス面積は、RGはCGの約半分、２）シナプス内に発現しているAMPA型グルタミン酸受容体の平均数は同程度、したがって、３）受容体密度は、RGのほうがCGの倍程度の違いがあること等が明らかになった（図１）。

ここで疑問になった点は、シナプスにおける信号伝達の強さを決める要因として、シナプス内での受容体の「総数」あるいは「密度」のどちらが重要なのかという点であった。シナプス間隙でのグルタミン酸拡散、および受容体応答をシミュレーションしたところ、単一シナプスの素量応答の強度を決めるのは、シナプス内に発現している受容体の「数」であって、受容体「密度」や受容体の不均一な分布は、シナプス伝達の強度やばらつきを決めるのには、あまり大きな役割を果たしていないことが予測された（図２）。そこで、個々のシナプス入力を電気生理学的に記録したところ、AMPA受容体を介した素量応答は、RGおよびCGで差がないことが明らかになった。単一シナプス応答の振幅及びばらつきは、多少の受容体分布様式の違いに左右されず、もっぱら受容体の数だけで規定されるように、シナプスはコンパクトな構造を形作っていることが示唆された。

論文情報

Etsuko Tarusawa, Ko Matsui^*, Timotheus Budisantoso, Elek Molnár, Masahiko Watanabe, Minoru Matsui, Yugo Fukazawa^*, Ryuichi Shigemoto (2009)
Input-Specific Intrasynaptic Arrangements of Ionotropic Glutamate Receptors and Their Impact on Postsynaptic Responses.
The Journal of Neuroscience, 29(41):12896-12908.
(^* Corresponding authors)

【図１】 入力元の異なるシナプス間では、シナプス形態・受容体分布が異なる

外側膝状体中継細胞のシナプス後部の凍結割断レプリカ標識像。皮質（CG）からのシナプス、網膜（RG）からのシナプスの例。黒線で囲まれた領域がシナプス部位、黒点はAMPA型グルタミン酸受容体の標識の位置。CGシナプスのほうが面積が広いが、どちらのシナプスもAMPA受容体の標識数は同程度であるので、AMPA受容体の密度としては、RGのほうが高い。また、CGシナプスには、AMPA受容体標識の少ない箇所が見られ、AMPA受容体分布が不均一である。

【図２】 多様なAMPA受容体分布が与えるシナプス応答への影響の解析

凍結割断レプリカ標識で明らかにされた、CGおよびRGシナプスのAMPA受容体分布をもとに、グルタミン酸拡散および受容体応答のシミュレーションを行なった。左図では、AMPA受容体の位置が黒点で表示されている。AMPA受容体クラスター付近（赤四角）で、グルタミン酸放出が起きた場合に生じるシナプス応答波形が、中図の赤線で表示されている。受容体の少ない空白地帯（黄四角）で放出が起きた場合のシナプス応答波形は、中図の黄線。放出部位に応じたシナプス応答振幅を、左図でグレースケール表示。右図は、シナプス応答振幅のヒストグラム。シミュレーションにより、１）シナプス応答振幅は、放出部位にあまり依存しないこと、２）受容体密度の異なるCGおよびRGシナプス間で、シナプス応答振幅に大きな違いは見られないこと、３）シナプス応答振幅を規定するのは、もっぱら受容体の数であること、などが明らかになった。

レプチンは脂肪細胞から分泌されるエネルギー代謝調節ホルモンである。しかし、近年レプチンが、末梢組織の糖代謝にも重要な調節作用を営むことが明らかとなってきた。事実、先天的あるいは後天的に全身の脂肪組織が萎縮する脂肪萎縮症の患者において、血中レプチン濃度が低値となり、その結果、重篤な糖尿病を発症することが明らかとなった。また、レプチンを投与し、血中レプチン濃度を正常レベルに回復させると、糖尿病が著しく改善することも示された。それゆえレプチンは、現在、脂肪萎縮症の特効薬として利用されている。このようなレプチンの調節作用は、中枢神経系、特にレプチン受容体を豊富に発現する視床下部を介すると考えられるが（図Ａ）、視床下部のどの神経核が重要であるかは不明であった。

我々は、視床下部の様々な神経核に選択的にレプチンを投与し、末梢組織における糖取り込みを測定した。その結果、視床下部の中でも特に、腹内側核（ＶＭＨ）が重要であることを明らかにした（図Ｂ）。さらに、レプチンをＶＭＨに投与したときの末梢組織での糖取り込みは、Pro-opiomelanocortin(ＰＯＭＣ)ニューロンと呼ばれる弓状核の摂食調節ニューロンを活性化し、活性化したＰＯＭＣニューロンがＶＭＨあるいは室傍核のメラノコルチン受容体（ＭＣＲ）を介して、末梢組織への糖取り込みを促進することを明らかにした。さらに、ＶＭＨのＭＣＲは骨格筋、褐色脂肪および心臓の糖取り込みを、室傍核のＭＣＲは褐色脂肪での糖取り込みを促進することも明らかにした（図Ｂ）。

本研究は、レプチン及び視床下部を介する糖代謝調節機構、抗糖尿病作用の解明に大きく貢献する研究成果である。

【図】

論文情報

Distinct effects of leptin and a melanocortin receptor agonist injected into medial hypothalamic nuclei on glucose uptake in peripheral tissues.
Toda C, Shiuchi T, Lee S, Yamato-Esaki M, Fujino Y, Suzuki A, Okamoto S, Minokoshi Y
Diabetes 2009 (Webにて公開)

脊髄に損傷を受けると手足の麻痺が生じるが、その後に運動機能の回復が見られることがある。機能回復の背景として、大脳皮質レベルの神経活動変化による機能代償がある(Nishimura Y, et al, 2007)。このような神経活動の変化を実現するために、大脳皮質において神経回路の再編成が生じていると考えられる。ただし、脊髄損傷後に大脳皮質レベルで神経回路の再編成が生じているという知見はこれまでにほとんど得られていなかった。

本研究では回復過程で生じる神経回路の変化を調べるため、神経突起の伸長に関わるタンパクであるGAP-43の遺伝子発現に着目した。すなわち、サル皮質脊髄路損傷後の機能回復過程におけるGAP-43遺伝子の発現変化を、大脳皮質運動関連領野において解析した(図A)。その結果、皮質脊髄路の損傷を受けたサルでは、回復時に両半球の第一次運動野(M1)のII-III層に存在する興奮性ニューロンにおいてGAP-43遺伝子の発現上昇がみられた(図B上)。またM1のV層に存在する大型ニューロンでも、両側性に発現の上昇がみられた(図B下)。さらに運動前野腹側部(PMv)や第一次体性感覚野(S1)においてもII-III層のニューロンでGAP-43遺伝子の発現上昇がみられた。これらの結果は、M1とPMv、S1を含む運動関連領野間の皮質間投射、および第一次運動野から皮質下への投射を担う神経細胞で可塑的な変化が生じていることを示す(図C)。

本研究成果は、脊髄損傷後に大脳皮質レベルの神経回路再編成が実際に生じており、それが機能代償に関与していることを示唆するものである。今後は回復過程で生じる投射レベルの変化や、神経回路変化を引き起こす遺伝子発現動態を明らかにしていく予定である。

論文情報

Increased expression of the growth-associated protein 43 gene in the sensorimotor cortex of the macaque monkey after lesioning the lateral corticospinal tract.
Noriyuki Higo, Yukio Nishimura, Yumi Murata, Takao Oishi, Kimika Yoshino-Saito, Masahito Takahashi, Fumiharu Tsuboi, Tadashi Isa
The Journal of Comparative Neurology 516: 493-506 (2009)

図

大脳皮質の神経回路は興奮性の錐体細胞と抑制性の介在細胞から成り立っており、介在細胞によって興奮性ネットワークが制御されている。錐体細胞間では、皮質外投射先や発火様式に依存して特異的にシナプス結合がなされ、サブネットワークを形成していることが次第に明らかになってきている。しかし、多様な細胞タイプからなる抑制性介在細胞と興奮性サブネットワークとの関係はよく知られていない。

今回、5層介在細胞と興奮性サブネットワークとの関係について、ラットの前頭皮質スライス標本を用いて検討した。5層介在細胞は電気生理学的にFast Spiking (FS)細胞とnon-FS細胞に分類したが、記録したnon-FS細胞の多くは形態学的にマルティノッティ細胞であった。最初に層内での結合特異性を検討するために、5層の介在細胞と錐体細胞から同時にホールセル記録した。その結果、FS細胞と錐体細胞間では両方向性のシナプス結合が多くの細胞ペアで見られたのに対して、non-FS細胞と錐体細胞間では双方向結合は殆ど見られなかった。また、双方向結合していたFS/錐体細胞ペアの興奮性・抑制性シナプス電流の振幅は、一方向結合のものと比べて大きかった。次に異なる層からの興奮性入力パタンを検討するために、グルタミン酸刺激法を用いて2/3層錐体細胞から5層の介在細胞と錐体細胞に共通入力する確率について調べた。その結果、5層のnon-FS細胞と錐体細胞では、その間にシナプス結合があると2/3層錐体細胞から共通入力する確率が高くなったのに対して、5層FS/錐体細胞ペアに対する2/3層錐体細胞からの共通入力確率は5層細胞間の結合の有無に依存しなかった。

以上の結果から、5層の介在細胞は細胞タイプに依存して錐体細胞と層内・層間の異なるサブネットワークを形成しており、興奮性ネットワークの抑制様式が介在細胞タイプごとに異なることが示唆された（下図）。

論文情報

Otsuka T, Kawaguchi Y (2009) Cortical Inhibitory Cell Types Differentially Form Intralaminar and Interlaminar Subnetworks with Excitatory Neurons. The Journal of Neuroscience, 29(34), 10533-10540

【図１】 

Schematic diagram of intra- and interlaminar subnetworks of pyramidal cells and interneurons. Line thickness represents connection probabilities. Triangles and circles indicate pyramidal cells and interneurons, respectively.

論文情報

Tomoko Fukumi-Tominaga, Yoshiko Mori, Atsuko Matsuura, Keiko Kaneko, Makoto Matsui1,2, Masato Ogata and Makoto Tominaga
DIP/WISH-Deficient Mice Reveal Dia- and N-WASP-interacting Protein (DIP/WISH) As a Regulator of Cytoskeletal Dynamics in Embryonic Fibroblasts
Genes to Cells 14 (10): 1197-1207, 2009

【図１】

野生型マウス胎仔線維芽細胞（WT）はPDGF刺激に応じてよく動くが（★印は接着斑様構造を示す）、DIP/WISH欠損マウス胎仔線維芽細胞（KO）は細長い形状をしており、ほとんど動かない。核の移動距離で比較すると、DIP/WISH欠損マウス胎仔線維芽細胞は野生型マウス胎仔線維芽細胞に比べて有意に短い。* p < 0.05.

では、このシナプス前抑制は覚醒動物の行動制御において、どのような役割を果たすのであろうか。残念ながらこの問いに対する明確な答えは見つかっていない。それを明らかにするためには、まず覚醒動物の行動下におけるシナプス前抑制を評価する方法を確立する必要があった。そのため、我々は覚醒サルに手首屈曲伸展運動を訓練し、その際の皮膚神経(superficial radial nerve)へ電気刺激を与えながら、刺激に単シナプス性に応じる細胞を検索した（図A）。その後当該脊髄部位に微弱電流刺激を繰り返し与え、皮膚神経において逆行性電位を記録した(図B)。さらに、その逆行性電位のサイズを手首運動の各局面で比較した結果、動的な運動の開始前後でそのサイズが増大することが確認された(図C)。この逆行性電位の振幅増大は、一次求心神経末端部の脱分極（primary afferent depolarization:PAD）を反映しており、さらにPADはGABA-Aによるシナプス前抑制の指標になることが知られている（excitability testing）。従って、この結果は随意運動における動的運動開始前後に、皮膚神経へのシナプス前抑制が増大することを示している。 　

本研究によって、覚醒行動下のサルにおけるシナプス前抑制の評価方法が始めて体系的に確立した。今後は同方法を用いて、様々な随意運動の局面や様々なモダリティの感覚入力に対するシナプス前抑制の動態が明らかにされることが期待される。

論文情報

Task-dependent modulation of primary afferent depolarization in cervical spinal cord of monkeys performing an instructed delay task.
Kazuhiko SEKI, Steve I. Perlmutter, Eberhard E. Fetz
Journal of Neurophysiology 102: 85-99 (2009)

図１

• 大脳皮質と筋電図の間のベータ周波数領域（14-30 Hz）のDTFは、皮質から筋電図へ向かう方向が逆方向よりも優位で、中心溝の前壁（運動野）で最も大きい。
• 皮質皮質間のベータ周波数領域のDTFについては、筋収縮中は中心溝後部（感覚野）から中心溝前部（運動野）への向きが逆向きよりも優位であった。この前向きと後向きのDTFの非対称性は、休んでいるときには、はっきりとは認められなかった。

これらの知見は、感覚野から運動野へ向かうベータ周波数領域での情報の流れが運動のフィードバック制御などの筋収縮調節の重要な要素となっている可能性を示唆している。

論文情報

Tsujimoto T, Mima T, Shimazu H, Isomura Y
Directional organization of sensorimotor oscillatory activity related to the electromyogram in the monkey.
Clinical Neurophysiology 120 (2009) 1168-1173

図１

大脳皮質の局所神経回路構築を解析する上で、各種神経細胞上にどれほどのシナプス結合があるかを解析する事は非常に大事な事である。その解析方法として、連続超薄切切片を電子顕微鏡を使って観察し、神経組織を３次元再構築し解析する方法が考えられる。私達は、この方法を使い、これまで、多くの神経細胞を解析してきたが、下記の２つの問題点に気がついた。１）超薄切切片の厚みの正確な測定が、３次元再構築像の質を大きく左右する。２）切片面に平行あるいは平行に近い角度に存在するクレフト面を持つシナプス結合は、従来のシナプス結合の定義による観察では見逃してしまう為、本来のシナプス入力の密度よりもかなり少ないシナプス数しか探知出来ない。これら２つの問題点を改善する為に下記の方法を今回報告した。まず、超薄切切片の厚み測定方法であるが、従来、minimal folding法、干渉光測定法、ミトコンドリアを利用した推測法が使われて来たが、いずれも、必ずしも正確な厚みを測定する方法とは言えない。私達は、1nmの解像度を持つカラー３Dレーザ顕微鏡を使って超薄切切片の厚みを測定し、信頼できる測定が可能である事を確認した。次に、シナプス結合の同定に関して、切片面に平行あるいは平行に近い角度のクレフト面を持つシナプス結合は、連続切片で、従来のシナプス結合の同定の為の定義の順序通りにシナプス要素が観察できる場合はシナプス結合と判断して良い事を、tomography解析等により見出した。シナプス確認の為の新しいこの方法を使って、parvalbumin陽性樹状突起表面に入力するシナプスの数を測定した所、およそ１／３から半分程度のシナプスを新たに確認する事ができた。この事は、旧来のシナプス同定法だけを使った場合、シナプスの多くを見落としてしまう事を示している。今後は、この新しい方法を使った、神経回路構築の定量的解析が望まれる所である。

Kubota Y, Hatada S, Kawaguchi Y (2009)

Important factors for the three-dimensional reconstruction of neuronal structures from serial ultrathin sections

Frontiers in Neural Circuits, Volume 3, Article 4

(A, D) 切片面に平行あるいは平行に近い角度のクレフト面を持つシナプス結合を連続切片（７０nm）でとらえた電子顕微鏡像。従来のシナプス結合の同定の為の定義の順序通りにシナプス要素が観察できる。 (A) 前神経終末にはシナプス小包が多く存在する（星印） (B) 前神経終末格子 (C) シナプス後膜肥厚（PSD） (D) シナプス後樹状突起の細胞質 (E, F) 左の連続写真から作成したパルブアルブミン陽性樹状突起（黄色）とそれにシナプス接着しているGABA陽性神経終末（赤色）GABA陰性神経終末（青色）パルブアルブミン陽性神経終末（桃色）(E) 従来のシナプス同定方法で確認できたシナプス神経終末。手前正面にはシナプス神経終末が分布していないのがわかる。 (F) 本研究で提唱した新しい同定方法で確認できたシナプス神経終末を加えて再構築した像。樹状突起の表面全体が神経終末で覆われているのがわかる。

Important factors for the three-dimensional reconstruction of neuronal structures from serial ultrathin sections

Quantitative analysis of anatomical synaptic connectivity in microcircuits depends upon accurate 3-dimentional reconstructions of synaptic ultrastructure using electron microscopy of serial ultrathin sections. Here we address two pitfalls in current methodology that lead to inaccurate reconstructions and compromise conclusions drawn from the data. The first pitfall is inaccurate determination of ultrathin section thickness, which negatively affects the three-dimensional shape of reconstructions and therefore impairs quantitative measurement of synaptic structures. Secondly, current methodology significantly underestimates the number of synaptic junctions, with only two-thirds or less of genuine synaptic contacts being identified in dendrites that radiate within the plane of section. Here we propose a new methodology utilizing precise optical measurements of section thickness and successive observations of synaptic elements across serial ultrathin sections that corrects for these limitations to allow accurate 3-dimentional reconstruction of synaptic ultrastructure. We use this methodology to reveal that parvalbumin (PV)-expressing cortical interneurons have a much higher synaptic density than previously shown. This result suggests that this technique will be useful for re-examining synaptic connectivity of other cell types.

3次元上に配置された102個の脳磁場センサー（四角形、左後ろから見た図）と頂点潜時の反応を示す。センサーの色はその位置での反応強度（青から赤になるにつれて大きくなる）を示す。センサーから出ている４つの色の線分は、それぞれ刺激の運動方向（シアン：右、マゼンタ：上、白：左、黄色：下）と測定された反応の電流モーメントの大きさ（線分の長さ）、方向（線分の方向）を示す。

MEG response waveform carries direction information of visually presented motion stimulus. This figure shows 3-dimensional illustration of the current vectors (shown by the colored lines) for 4 motion directions measured at each sensor location shown by the square at around the peak of the response (viewing from left posterior). The color of the line indicates motion direction (cyan: rightward; magenta: upward; white: leftward; yellow: downward) and the length corresponds to the current moment. The color of the square shows the magnetic field strength (that increases from blue to red) measured at the sensor.

　運動する物体を見たとき、人は常に２つの性質の異なる情報を知覚する。ひとつは方向であり、もうひとつは速度である。物理学的にもいずれかひとつしかない運動はありえない。つまり何かが動いたと知覚するとき、その方向はわからないが速さはわかったとか、速かったけれどどっちに動いたかわからいということはない。よって運動情報は方向と速度という大きさを持ったベクトルとして表現される。実際、運動は初期視覚野ではベクトルとして検出されているらしい多くの証拠がある。局所で検出された運動情報はより広い視覚野の中であるまとまった物体の運動として認知されて、初めて意味をなす。例えば、人が歩いているときの個々の箇所（手先や肩、足）の運動は非常に複雑で方向も速度もまちまちであるが、それらが全体的に統合されて始めて歩行というひとつの行動が認知される。このような局所運動の統合にも脳は運動ベクトルを用いて行うと信じられてきた。一方種々の心理実験によって、かならずしもそうではない可能性が指摘されている。今回の研究は、方向と速度が別々に処理されているという明瞭な生理学的知見を示すものである。

　実験は、8名の健康成人から種々の運動刺激に対する脳反応を脳磁図にて記録した。反応潜時は速度に反比例して変化し、その変化は運動方向で変わりはなかった。運動方向に関する情報エントロピーを計算すると、反応前と比して反応後（特に頂点潜時以降）に有意に大きくなることがわかった。これは脳磁場反応の波形に運動方向の情報が含まれていることを示す。そこで、反応潜時、振幅、反応の７５％幅にて方向が推定できるか検討したところ、統計的に有意な正答率で推定でき、その推定パラメーターや正答率は速度に依存しなかった。これらの結果は、速度情報は反応潜時に特異的に表現されており、方向は反応波形の違いにより表現されていることがわかった。すなわち、速度と方向はそれぞれ独立に脳反応波形に表現されていた。これは、２つの情報が脳で別々に（少なくともある一部の段階で）取り扱われていることを示す。

　この結果は、著者自身が提唱する視覚性運動情報処理に関するscalar fields theory （Kaneoke Y, Prog. Neurobiol. 80, 219-240, 2006）を支持するものであり、また色、形などの他の情報との結合問題の解明につながる可能性がある。なお、本研究に関する図が表紙に採用された。

Kaneoke Y, Urakawa T, and Kakigi R.
Visual motion direction is represented in population-level neural response as measured by magnetoencephalography.
Neuroscience 160, 676-687, 2009.

ひとつのセンサーが記録した脳磁場反応波形を左図に示す（個人のデータ）。反応の頂点潜時は約160msで、そのあとに波形が刺激方向によりばらついている。右図は、刺激前後の情報エントロピーの変化（交互情報エントロピー）を示す。反応の頂点潜時（時間：0 ms）後約40msでもっとも情報エントロピーが大きくなることがわかる（85セットの反応におけるデータ）。n bitは、2のｎ乗を示し、ここでは１bitは２つの運動方向の情報をもつことを示す。

Visual motion direction is represented in population-level neural
response as measured by magnetoencephalography

We investigated whether direction information is represented in the population-level neural response evoked by the visual motion stimulus, as measured by magnetoencephalography. Coherent motions with varied speed, varied direction, and different coherence level were presented using random dot kinematography. Peak latency of responses to motion onset was inversely related to speed in all directions, as previously reported, but no significant effect of direction on latency changes was identified. Mutual information entropy (IE) calculated using four-direction response data increased significantly (>2.14) after motion onset in 41.3% of response data and maximum IE was distributed at approximately 20 ms after peak response latency. When response waveforms showing significant differences (by multivariate discriminant analysis) in distribution of the three waveform parameters (peak amplitude, peak latency, and 75% waveform width) with stimulus directions were analyzed, 87 waveform stimulus directions (80.6%) were correctly estimated using these parameters. Correct estimation rate was unaffected by stimulus speed, but was affected by coherence level, even though both speed and coherence affected response amplitude similarly. Our results indicate that speed and direction of stimulus motion are represented in the distinct properties of a response waveform, suggesting that the human brain processes speed and direction separately, at least in part.

あいまいな刺激に対する脳反応。 図は刺激後160msでの反応の振幅（102chの脳磁場記録によるほぼ脳全体の反応）を左前から見た図で示す。上は左右運動知覚時、下は上下運動知覚時の反応。後頭部に明瞭な振幅の差を認める。 Human primary visual response to the same motion stimulus was varied with the perception but not with the stimulus. The figure shows the three dimensional magnetic field gradient maps of the responses for the two perceptions (viewing from the left anterior). Top: horizontal motion perception; bottom: vertical motion perception to the same bistable apparent motion stimulus.

　じっと見ていると老婆に見えたり若い娘にみえたりするような視覚刺激は以前から多くの研究者の興味を集めている。それは、外部からの刺激の変化によらない脳内で自発的に起こる神経活動の変化をとらえることは、脳科学の究極の課題である意識の成り立ちを解く鍵となるからである。これまでの研究のほとんどは、知覚が例えば老婆から娘に交代する神経機構の探求であった。ところで、ひとつの知覚（例えば老婆）がおきるとその知覚は他の知覚（娘）に交代するまで数秒からあるときは数分間も保持されるのは、なぜであろうか？このなぞが解ければ、知覚交代のメカニズムにも迫れるかもしれない。我々は、2通りの運動知覚（上下または左右）が交代して起こる視覚刺激（仮現運動）をもちいて、このなぞにせまった。視覚刺激は1秒に4回の早さで与え続けると、250msごとにその刺激に対する反応が脳磁図（MEG）で記録される。頂点潜時は150－160msで、これまでに調べられた視覚性運動刺激に対する反応と変わりなかった。従って、認知などに関係するといわれる潜時300msの反応とは異なり、単純に刺激に視覚野が反応したものである。驚いたことに、被験者が上下の運動を知覚しているときの反応と左右の運動を知覚しているときの反応を比べると潜時160ms付近で明瞭な振幅の差が見られた。刺激はまったく同じにも関わらずである。さらに驚くべきことは、刺激を物理的に変えて強制的に上下や左右の運動しか見えない刺激を与えて反応を記録しても、知覚も刺激も違うにもかかわらず反応には明瞭な差はみられなかった。よって、あいまいな刺激のみに反応が変化したことは方向選択性ニューロンの特性などでは説明できず、あいまい刺激から明瞭な知覚を得るときのみに起こる神経活動が存在し、それは初期視覚野にあることを示す。さらにその神経活動は、刺激を受けてから惹起されるわけではない。数十秒も同じ知覚が持続することは、視覚野のその刺激に対する反応特性がその間維持されていることを示す。つまり、250msごとに繰り返される刺激にどう反応するかあらかじめ決定されているのである。このメカニズムはまだ不明であるが、もっとも考えやすいのは視覚野neural network のシナプス特性に反応特性が刻み込まれるというものである。これは、ラジオで受信回路の特性をある一定の周波数に合わせることに対応する。本研究は、東京大学大学院総合文化研究科村上郁也准教授との共同研究である。また、本研究に関連する図が表紙に採用された。

Kaneoke Y, Urakawa T, Hirai M, Kakigi R, and Murakami I. Neural basis of stable perception of an ambiguous apparent motion stimulus Neuroscience 159(1), 150-160, 2009.

  【図１】　あいまい刺激とその反応

A.刺激は２つの図を250msごとに提示することにより、2つのうちひとつの知覚が惹起される。（赤：上下運動知覚時の反応、青：左右運動知覚時の反応）B.8名の被験者の反応の振幅差。C.160ms付近で、被験者全員の反応に有意な差が見られる。

  【図２】　ひとつの知覚のみ惹起する刺激に対する反応

２とおりのあいまいでない刺激（A,B）において、反応に違いはみられない。

  【図３】　結果の説明

あいまいな刺激（Ambigous motion）では、脳（視覚野）の反応特性が変化することにより、２つの知覚が惹起される。あいまいでない刺激のときは、刺激の特性に応じて脳が反応して、知覚が惹起される。

Neural basis of stable perception of an ambiguous apparent motion stimulus

Although it has been shown that an alternative dominant percept induced by an ambiguous visual scene has neural correlates in various cortical areas, it is not known how such a dominant percept is maintained until it switches to another. We measured the primary visual response to the two-frame bistable apparent motion stimulus (stroboscopic alternative motion) when observers continuously perceived one motion and compared this with the response for another motion using magnetoencephalography. We observed a response component at around 160 ms after the frame change, the amplitude of which depended on the perceived motion. In contrast, brain responses to less ambiguous and physically unambiguous motions in both the horizontal and vertical directions did not evoke such a component. The differential response evoked by the bistable apparent motion is therefore distinct from directionally-selective visual responses. The results indicate the existence of neural activity related to establish and maintain one dominant percept, the magnitude of which is related to the ambiguity of the stimulus. This is in the line with the currently proposed idea that dominant percept is established in the distributed cortical areas including the early visual areas. Further, the existence of the neural activity induced only by the ambiguous image suggests that the competitive neural activities for the two possible percepts exist even when one dominant image is continuously perceived.

複数の物体が存在する環境から目標となる物体を見つけ出す視覚探索では、視野内に存在する個々の物体の刺激特徴情報と、どのような物体を目標として探すのかを決める行動課題情報が重要となる。しかしながら、目標となる物体が特定され、その物体に視線方向を向けるためには、刺激特徴や行動課題の情報よりも目標物体の場所を特定する位置情報の方がより重要になると思われる。このように視覚探索の処理過程では、必要不可欠となる情報が処理の進行とともに質的に変化する。すなわち、 非空間性選択過程（nonspatial, feature-based target selection）から空間性選択過程（spatial-based target selection）へ移行すると考えられる。

先行研究による神経生理学的知見は、このような情報の質的変換が行われる脳部位として後頭頂葉におけるLIP野（the lateral intraparietal area）と7a野の重要性を示唆している。LIP野と7a野は視覚‐運動野であり、視覚選択、空間性注意、期待 、及びサッカード眼球運動の準備に関連したニューロン活動が報告されている。 一方、LIP野には色や形などの刺激特徴を表現するニューロン活動も報告され、視覚野としての特性も有していることが知られている。このように、LIP野と7a野は非空間性から空間性の選択過程への移行を実行するための脳部位として、最も適した処理段階に位置していると考えられる。

本研究では、このような変換過程における後頭頂葉の役割を明らかにするため、探索条件に応じて目標刺激が決まり、目標刺激の刺激特徴が多様に変化する視覚探索課題をサルに行わせ、LIP野と7a野から単一ニューロン活動を記録した。その結果、一部のニューロン群では、目標刺激が特定の刺激特徴をもち、かつ特定の探索条件で探索されているときのみ目標刺激の位置を反映した（variant type neuron）。一方、別のニューロン群は、そのような刺激特徴や探索条件に対する依存性は示さず、いつでも目標刺激の位置を反映するニューロン活動を示した（invariant type neuron）。これらの結果は、非空間性と空間性選択過程が後頭頂葉の同一領域に混在することを示し、非空間性から空間性選択過程への変換過程の場として後頭頂葉（LIP野、7a野）が重要な役割を果たしていることを示唆する。

論文情報

Ogawa T and Komatsu H
Condition-dependent and condition-independent target selection in the macaque posterior parietal cortex.
J Neurophysiology, 101:721-736, 2009.

【図１】 多次元視覚探索課題

仮想円周上に6個の刺激要素から成る刺激アレイを呈示し、その中から目標となる刺激を探す視覚探索課題をサルに訓練する。各刺激アレイは、形も色も同一である4つの背景刺激（nonsingleton）、形次元で背景刺激と異なる１つの刺激（shape singleton）、及び色次元で背景刺激と異なる１つの刺激（color singleton）から構成される。各刺激要素は、2種類の形（縦棒、円形）と2種類の色（水色、黄色）から構成される。探索条件には2種類あり、形次元探索（shape search）のときは shape singleton が目標刺激となり、color singeton は妨害刺激となる （上段）。色次元探索（color search）のときは、それら2つの刺激の役割は入れ替わる（下段）。探索条件は注視期間中に呈示される注視点の色を変化させることにより教示される。

【図２】 目標刺激に対する応答が刺激特徴や探索条件に強く依存するニューロンの例　（variant type neuron）

目標刺激に対する活動の増強が、特定の刺激特徴と探索条件が組合わさったとき特異的に生じた。形次元探索の条件下で、黄色&縦棒の刺激が受容野に目標刺激として呈示されたときのみ顕著な活動増強を示し（A、赤線）、妨害刺激や背景刺激に対する活動（青線、緑線）よりも大きくなった。一方、目標刺激の刺激特徴が水色&丸型に変化した場合（B、赤線）、探索条件が色次元探索に変化した場合（C、緑線）、及び刺激特徴と探索条件の両方が変化した場合（D、緑線）、目標刺激に対するニューロン活動の強度は著しく減衰し、妨害刺激や背景刺激に対するニューロン活動との差異が消失した。

【図３】 目標刺激に対する応答が刺激特徴や探索条件に依存しないニューロンの例　（invariant type neuron）

刺激特徴と探索条件にかかわらず、目標刺激が受容野に呈示されたときニューロン活動の増強が生じた。色次元探索の条件下において、受容野に黄色&縦棒刺激が呈示されたときにニューロン活動は最大応答を示し（C、緑線）、妨害刺激や背景刺激に対するニューロン活動よりも大きくなった。目標刺激の刺激特徴が水色&丸型に変化した場合（D、緑線）、探索条件が形次元探索に変化した場合（A、赤線）、及び刺激特徴と探索条件の両方が変化した場合でも（B、赤線）、目標刺激に対して顕著なニューロン活動の増強を示し、その活動強度は最大応答の場合と差異がなかった。

A parietal neuron showing no dependence on stimulus features or the target-defining dimension. The activity of this neuron always exhibited significant discrimination of the target from the other stimuli, irrespective of the stimulus features and target-defining dimension. Conventions are the same as in Fig. 2.

【図４】 後頭頂葉ニューロンのポピュレーション応答

炎症時初期に生成されるブラジキニンが、脳内の主要なグリア細胞であるアストロサイトに作用すると、そこからグルタミン酸放出が誘起され、それが隣接するニューロンへの情報伝達に寄与することが知られている。最近我々は、そのブラジキニンにより誘起される情報伝達がアストロサイト上の容積感受性外向整流性アニオンチャネル（VSOR）を介して行われることを明らかにした。マウス大脳皮質由来のグリア・ニューロン共培養系に対しブラジキニン（1 μM）を投与すると、アストロサイトから放出されたグルタミン酸がニューロン上のNMDA受容体を活性化し、そのニューロン内にCa²⁺濃度上昇が引き起こすが、その上昇はVSOR阻害剤であるDIDSやphloretin投与により抑制された。実際のグルタミン酸放出量もそれらの阻害剤や高張溶液刺激により減少したが、開口放出阻害剤であるテタヌス毒素は放出量に影響しなかった。アストロサイトに対しwhole-cell電流記録を行うと、ブラジキニン投与中VSOR電流の増強が認められ、細胞内Cl^-のグルタミン酸置換による逆転電位のシフトの程度から、VSORの有意なグルタミン酸透過性が示唆された。しかし、ブラジキニン投与中アストロサイトの細胞容積にはほとんど変化が認められず、一方で投与中細胞内に活性酸素種（ROS）の生成が認められ、ROS生成阻害剤の投与によりVSOR活性化が阻止されることも判明した。以上のことから、ブラジキニンの作用によりアストロサイト内に生成されたROSが細胞容積変化によらず直接VSORを活性化し、そのVSORを通じてグルタミン酸が放出される機序が示唆された。この機序は、脳内炎症時のニューロン過興奮や膨張・浮腫等の病態の背景となっていると考えられる。

論文情報

Liu　HT, Akita T, Shimizu T, Sabirov RZ, and Okada Y (2009) Bradykinin-induced astrocyte-neuron signalling: glutamate release is mediated by ROS-activated volume-sensitive outwardly rectifying anion channels. J. Physiol. published online on February 2, DOI: 10.1113⁄jphysiol.2008.165084

【図１】 

ブラジキニンはアストロサイト上のB2受容体への結合を通じてアストロサイト内にCa²⁺濃度（[Ca²⁺]_i）上昇を引き起こすと同時に、NADPH oxidase（NOX）を活性化してROS合成を促進する。生成されたROSはVSORを開口させ、そのアニオンチャネルを通じてグルタミン酸が隣接するニューロンに向かって放出される。放出されたグルタミン酸はニューロン上のNMDA受容体活性化を通じてニューロン内にCa²⁺濃度上昇をもたらす。

P2X₂ チャネルは、細胞外のATPによって活性化される非選択性陽イオンチャネルで、ATP 投与後の時間経過や細胞膜上の発現密度に依存してチャネルポアの拡大が起こることなどから、その構造と構造の動的変化に興味が持たれている。我々は、P2X₂に関して、先に、レコンビナント蛋白を用いたクロスリンクの実験結果と、ウラニル酢酸負染色像に基づいた単粒子構造解析の結果に基づき、70kDのサブユニットの3量体で、疎でかさばった細胞外領域を持つ構造を示すことを発表した (Biochem Biophys Res Commun (2005) 337: 998-1005. Mio, Kubo, Ogura, Yamamoto and Sato)。

今回、より高解像度の構造を明らかにするために、90,000 個以上の極低温電子顕微鏡画像に基づく単粒子構造解析を行い、種々の角度から見た2次元像を得、さらに、3 次元画像の再構築を行った。また、画像上の細胞内領域側を、付加したFLAG tagに対する Fab-goldの結合側の決定により同定した。なお、ATP非存在下であるため、分子はclosed stateにあると考えられる。得られた三次元構造は、高さが202Å、直径が160Åの花瓶状を示した。細胞外領域と膜貫通領域においては、ポアを構成する内層を比較的疎な外層が取り囲む2層構造を示し、膜貫痛領域中程にはポアの再狭部と思われる部域が見られた。ATPは、細胞外領域の2 層の隙間にはりこむことによりATPaseによる分解から守られることが推測された。全体として疎に拡大した構造は、3 つのサブユニットがゆるく会合していることをイメージさせ、これがポア拡大現象の構造基盤となっていることが示唆された。

本研究は、産総研・脳神経情報・構造生理の佐藤主税氏の研究室（三尾、小椋、佐藤）を中心とする、京大院理・生物物理・構造生理の藤吉好則氏の研究室（廣明、藤吉）と、生理研・神経機能素子（山本、久保）の、共同研究による成果である。

論文情報

Mio K, Ogura T, Yamamoto T, Hiroaki Y, Fujiyoshi Y, Kubo Y and Sato C (2009) Reconstruction of the P2X₂ Receptor Reveals a Vase-Shaped Structure with Lateral Tunnels above the Membrane. Structure 17: 266-275.

【図１】 

P2X₂ の再構成3次元構造の表面像
A 左は、細胞外側からの top viewである。右は、水平軸に沿って回転した像で、右下隅が細胞内側からの bottom viewである。B 側面像。垂直軸に沿って回転した5つの像を示す。青線は、一次構造予測に従って分子量を細胞内外に割り振った計算による膜貫通部位を示す。

P2X₂ は、2つの膜貫通部位を持つサブユニット 3 個が会合して構成されるATP受容体チャネルである。我々は、この分子内に、膜電位センサーを思わせるような領域が全く無いにも関わらず、ATP 投与後の定常状態において、過分極時により活性化する、すなわち、膜電位依存的ゲート機構が存在するという興味深い現象を見いだした。さらに、その膜電位依存的ゲートがATP濃度に依存する、すなわち、ATP濃度が高いほど、コンダクタンス-電圧関係が脱分極側にシフトし、また、過分極ステップパルスを与えたときの活性化の速度が加速することを観察した。ATP の結合ステップと、その後の膜電位依存的ゲートステップからなる3ステートモデルを仮定し、実験値と、ATP結合に関する既報告値を元に、ゲートステップの種々の膜電位におけるrate constants を算出した。この値を用いて simulation を行ったところ、膜電位依存的ゲートステップに、（ATP投与後の定常状態であっても）ATP 濃度依存性が現れることを再現できた。これは、主として、結合ステップがゲートステップに比して速いことに起因する。一方、ATP 結合ステップに膜電位依存性があることを仮定したarbitrary なパラメターを用いて simulation を行ったところ、こちらは実験データに合わなかった。さらに、gating の最終ステップにおいてポアの開口につながる構造基盤を、種々の変異体を作成して探索し、第2膜貫通部位の中程にあるGly344 が、ゲートヒンジとして重要な役割を果たしていることを見いだした。

論文情報

Fujiwara Y, Keceli B, Nakajo K and Kubo Y (2009) Voltage- and [ATP]-　dependent gating of the P2X₂ ATP receptor channel. Journal of General Physiology 133: 93-109.

【図１】 

第2膜貫通部位の中程にあるGly 344 をAla に変異させたところ、過分極時の活性化が見られなくなった。このG344A 変異体をバックグランドとして用いて、344 の周辺のアミノ酸残基をGly に置き換えたところ、341, 346, 347 等において膜電位依存的ゲートが復活した。そのため、第2膜貫通部位の中程における、ヒンジとなるアミノ酸残基の存在が膜電位依存的ゲートに役割を果たしていることが示された。

Gタンパク質共役型受容体(GPCR)はヒトでは700種類以上存在し、平滑筋収縮や神経シナプス伝達等、様々な生理機能を制御する。GPCRを介した情報伝達経路は気管支喘息治療薬等、多くの薬剤の標的となっており、GPCR情報伝達経路の制御機構の解明は極めて重要である。今回、私共はGPCRを介した情報伝達において要となる3量体Gタンパク質αサブユニット(Gα)の細胞膜への局在を決定する脂質修飾酵素を同定した。さらに、本酵素によるGαの細胞膜への移行がGPCRを介した情報伝達に必須であることを見出した。

Gαは可逆的なパルミトイル化脂質修飾（炭素鎖１６からなる飽和脂肪酸パルミチン酸が蛋白質に付加される翻訳後脂質修飾）を介して細胞膜に局在し、GPCRを介した外界シグナルを細胞内の標的蛋白質に伝達する（図1）。しかし、Gαのパルミトイル化反応は酵素に依存しないという説が古くから提唱されるなど、その存否には議論が絶えなかった。今回、私共は23種のDHHCパルミトイル脂質転移酵素群を独自に開発してきたスクリーニング法によりスクリーニングし、DHHC3およびDHHC7がGα（Gα_q、Gα_sおよびGα_i2）のパルミトイル化レベルを著しく亢進させることを突き止めた。また、DHHC3およびDHHC7をノックダウン法により発現抑制させるとGα_q⁄11のパルミトイル化レベルが低下し、Gα_q⁄11が細胞膜から細胞質へ移行することを見出した。一方、光変換(photoconversion)技術を用いてGαqの細胞内動態の解析を行ったところ、Gαqは細胞膜に静的に存在するのではなく、細胞膜とDHHC3 ⁄ 7が局在するゴルジ装置の間をパルミトイル化依存的に双方向に行き来することを見出した（図２、３）。さらに、DHHC3 ⁄ 7のパルミトイル化酵素活性がGPCRの一つであるα_1Aアドレナリン受容体/Gα_q/11を介した情報伝達に必須であることを見出した。以上の結果より、パルミトイル化脂質酵素DHHC3 ⁄ 7がGαの細胞内局在を規定することによりGPCRを介した情報伝達を新たな機構で制御していることが明らかとなった。

http://mcb.asm.org/cgi/reprint/MCB.01144-08v1?view=long&pmid=19001095

論文情報

Identification of G-protein α subunit palmitoylating enzyme
Ryouhei Tsutsumi¹, Yuko Fukata^1,2, Jun Noritake¹, Tsuyoshi Iwanaga¹, Franck Perez^{3, 4}, and Masaki Fukata^1,2*
Molecular and Cellular Biology 2008

1. Division of Membrane Physiology, Department of Cell Physiology, National Institute for Physiological Sciences, Okazaki, Aichi 444-8787, Japan
2. PRESTO, Japan Science and Technology Agency, Chiyoda, Tokyo 102-0075, Japan
3. Centre National de la Recherche Scientifique, Unité Mixte de Recherche 144
4. Institut Curie Section Recherche, 75248 Paris Cedex 05, France

参考図

【図１】 GαはGPCRを介した外界シグナルを細胞内へ伝達する分子スイッチとして機能する

【図２】 GαはGPCRを介した外界シグナルを細胞内へ伝達する分子スイッチとして機能する

光変換により緑から赤（白色表示）に蛍光が変化するDendra2を融合させたGα_qをHeLa細胞に発現させ、細胞膜並びにゴルジ装置に存在するGα_qの動態を観察したところ、Gα_qは細胞膜とゴルジ装置の間を高速度で双方向に輸送されていることを見出した。上段はゴルジ装置に局在するDendra2-Gα_qを光変換し、10分以内に細胞膜に到達することを示し、下段は細胞膜に局在するDendra2-Gα_qを光変換し、10分以内に細胞膜全体とゴルジ装置に再分布する様子を示している。

【図３】 パルミトイル化を介したGα細胞内動態モデル

細胞膜上のGαは脱パルミトイル化されて細胞質に移行し、ゴルジ装置に存在するDHHC3 およびDHHC7により再パルミトイル化され一時的にゴルジ装置に集積する。Gαはその後Gβγとともに小胞輸送などにより細胞膜に移行する。PPT: 脱パルミトイル化酵素

今回、５層錐体細胞の発火特性をニューロンタイプの指標とし、２⁄３層錐体細胞から５層錐体細胞への興奮性結合における錐体細胞サブタイプ依存性について、ラットの前頭皮質でスライスパッチ法を用いて検討した。５層錐体細胞は電流注入に対する発火応答の違いから、１）電流注入中規則的にスパイクが発生する細胞（SA）、２）電流注入中１）の細胞と同じように規則的にスパイクが発生するが電流注入の最初でスパイクが2発バースト状に発生する細胞（SA-d）、（３）電流注入した時の最初の期間しかスパイクが発生しない細胞（FA）の３種類に分類した（図－A）。逆行性蛍光トレーサーで投射先を同定し記録した結果、対側線条体と同側橋核に投射する５層錐体細胞では、投射先と発火パタンに相関が見られた。

本研究では、２⁄３層細胞から５層細胞へのシナプス結合を容易に見つけるために、２⁄３層錐体細胞にグルタミン酸を短時間投与し発火させ、その際に５層錐体細胞で起きるシナプス電流を検出する方法を確立した。この方法では、単一または、同時記録する複数の細胞へのシナプス前細胞を、多数の細胞の中から検索することができる。２⁄３層から５層への興奮結合経路が５層錐体細胞の多様性に依存して選択的に分化しているのかを知るために、このグルタミン酸刺激法を使って、二つの５層錐体細胞が同一２⁄３層細胞から共通入力を受ける確率が、サブタイプの組み合わせやサブタイプ間のシナプス結合に影響されるのかを検討した。その結果、５層細胞が同一２⁄３層細胞から共通入力を受ける確率は、同じサブタイプペアーの方が異なるサブタイプペアーより高かった。さらに、同じ５層サブタイプペアーでは、サブタイプ間でシナプス結合があるものが無いものより共通入力を受ける確率が高くなり、一方、異なるサブタイプペアーが共通入力を受ける確率は５層間結合の有無に影響されなかった（図－B）。以上から、２⁄３層から５層への興奮結合が５層錐体細胞サブタイプやサブタイプ間の結合に依存してサブネットワークを形成していることがわかった。以前に５層内のシナプス結合が皮質外の投射先に依存して分化していることを明らかにしたが、２⁄３層からの結合も皮質下構造に対応した選択的経路を作っていると考えられる。

論文情報

Otsuka T, Kawaguchi Y (2008) Firing-pattern dependent specificity of cortical excitatory feed-forward subnetworks. The Journal of Neuroscience, 28(44), 11186-11195

参考図

【図１】 

A, Voltage responses to current injections in SA, SA-d, and FA type L5 pyramidal cells. Asterisk indicates initial doublet spikes. Inset in SA-d, initial doublet (*) at an expanded time scale and reduced voltage scale. B, Schematic diagram of interlaminar divergence selectivity from L2⁄3 to L5 pyramidal cells. Line thickness represents connection probabilities. Open and dark triangles indicate different pyramidal subtypes.

中脳上丘中間層（SGI）ニューロンのバースト発火は眼球サッケード運動などの指向運動の開始に重要である。黒質網様部(SNr)由来のGABA作動性入力はトニックにSGIの活動を抑制しており、この抑制からの解除がSGIニューロンのバースト発火の生成に必要であると考えられている。SGIにはグルタミン酸作動性投射ニューロン以外にGABA作動性ニューロンも多数存在する。しかし、SNrがこれらのGABA作動性ニューロンにも入力しているのか否かはこれまで明らかにされていなかった。そこで本研究では、神経トレーサーを用いた解剖学的解析とスライス標本での電気生理学的解析によりこの点を検討した。GABA作動性ニューロンがGFP蛍光を特異的に発現するGAD67-GFP knock-inマウスのSNrに順行性トレーサーのBDAを注入し、その神経終末を共焦点顕微鏡で調べたところ、SNr由来の神経終末がSGIのGABA作動性ニューロン上にシナプスを形成していることが分かった。次に、SNrとSGIをともに含むスライス標本を作製し、実際に抑制性シナプス伝達が観察できるかどうかを検討した。SGIのGFP陽性GABA作動性ニューロンからホールセルパッチクランプ記録を行いSNrを電気刺激すると、単シナプス性のIPSCsが誘発された。このIPSCsはGABA_A受容体アンタゴニストでブロックされたが、GABA_B受容体アンタゴニストでは影響を受けなかった。以上の結果は、SNr由来のGABA作動性投射がSGIのGABA作動性ニューロンに入力していること示しており、SNrが単にSGIでのバースト発火の開始を制御しているのみではなく、興奮性ニューロンの時空間的な活動特性の調節にも関与している可能性を示唆している。

論文情報

Katsuyuki Kaneda^1,2, Kaoru Isa^1,3, Yuchio Yanagawa⁴, and Tadashi Isa^1,2,3
Nigral inhibition of GABAergic neurons in mouse superior colliculus
Journal of Neuroscience, 28:11071-11078.

1. Department of Developmental Physiology, National Institute for Physiological Sciences, Myodaiji, Okazaki 444-8585, Japan
2. The Graduate University for Advanced Studies, Hayama, Kanagawa 240-0193, Japan
3. CREST, Japan Science and Technology Agency, Kawaguchi, 332-0012, Japan
4. Department of Genetic and Behavioral Neuroscience, Gunma University Graduate School of Medicine, Maebashi, 371-8511, Japan

参考図

【図１】 

黒質網様部からの軸索はGFP陽性の上丘中間層GABA作動性ニューロンにシナプス結合していた<

【図２】 

黒質と上丘をともに含むスライス標本の作製法を工夫することで、黒質網様部の電気刺激により上丘中間層GABA作動性ニューロンからIPSCが記録できた

【図３】 

上丘と黒質網様部をつなぐ抑制性神経回路の模式図

中脳背側にある上丘は、様々な感覚刺激に対して眼球や頭部を向ける指向運動の中枢として、また最近では空間的注意を制御する中枢として多くの研究の対象とされてきた。上丘には層構造があり、浅層は視覚入力を受けるのに対して、中間・深層は視覚以外の感覚入力や大脳皮質からの信号を受けるとともに、脳幹・脊髄に運動指令を出力する。上丘の浅層・深層が脳の他の部位とどのように接続しているかについては多くの研究がなされてきたが、上丘内部の局所神経回路に関する研究はこれまであまり進められてこなかった。本研究において我々は、マウス上丘スライス標本をデッシュの上に等間隔で配置された64チャンネルの電極の上に置き、フィールド電位記録および刺激法とホールセルクランプ法を組み合わせて、上丘内の広い範囲の多くの神経細胞集団においてどのように信号が伝搬するか、また上丘の異なる部位同士がどのように相互作用するかを解析した(図１)。

冠状断切片において、上丘浅層を電気刺激すると通常のリンゲル液中では浅層の最表層部に限局して陰性電位が記録されるのみであったが、細胞外液中に10μMのビククリンを投与してGABAA受容体をブロックすると、同じ強度の刺激によって短い潜時で浅層には大きな陰性電位、同時に中間層では大きな陽性電位が生じ、その後浅層で生じた陰性電位は次第に中間層から深層に向けて移動していった(図２)。このときに短潜時で中間層に誘発される陽性波は浅層で起きている電流シンクに対する電流源であり、平均21ms後から次第に減衰し、その後陰性波に転じて数百ms間持続した。これらの浅層・深層の大きな陰性波はNMDA受容体の拮抗薬であるAPVの投与によって消失したので、NMDA型グルタミン酸受容体依存性であると考えられる。さらに浅層や中間層のフィールド電極記録部位近くのニューロンからホールセル記録を行い、細胞内電位とフィールド電位を記録したところ、浅層の陰性電位はほぼ細胞内電位の興奮性シナプス後電位(EPSP)と時間経過が一致していた。一方で、中間層における陽性電位の期間中にはすでにEPSPが開始していること、細胞ごとでEPSPの持続期間は大きく異なり、必ずしもフィールド電位で記録される陰性波の時間経過とは一致しないことが明らかになった。つまり陰性波は様々な時間経過のEPSPを受けている細胞の集合であることが明らかになった。また、空間的に陰性波は浅層の深部から水平方向に拡大し、中間層で横幅が500μmを超えるように広範囲のニューロン群が同時に脱分極するようになることが見出された。以上の結果から浅層から深層への信号の伝搬機構、特に非常に広範囲のニューロン群が同時に興奮すること、また短潜時で浅層でEPSPが誘発されると中間・深層が電流源になるというフィールド電位の特徴的な生成機構が明らかになった。

本研究によって中脳上丘の局所神経回路の構造と機能の基本的に重要な知見を与え、上丘の機能についてのいくつかの重要な仮説を検証するための足掛かりを構築したといえる。それにより、動物の行動や注意の生成機構を解明するシステム神経科学の今後の発展に貢献する研究である。

論文情報

Phongphanphanee P, Kaneda K, Isa T (2008) Spatio-temporal profiles of field potentials in mouse superior colliculus analyzed by multichannel recording. Journal of Neuroscience, 28: 9309-9318.

参考図

【図１】 

６４チャンネルフィールド電位記録システム

【図２】 

６４チャンネルフィールド電位記録システムによって記録された上丘内の興奮電位の伝搬。浅層(白四角の位置)の電気刺激効果。Ａ：コントロール外液中。Ｂ：ビククリン10μM存在下。

細胞接着斑において、細胞内のアクチン細胞骨格は細胞外マトリックスにアンカーしている。この結合の強度は接着斑への力の付加により増強する。この反応は、細胞が運動したり、生体内での力学的変動に応じて形態を変化させたりすることに重要であると考えられている。アクチン骨格—マトリックス間結合の強化には、アクチン繊維の接着斑への集積が関わっていることが知られている。しかし、力に応答してアクチン繊維の量を調節する分子機構は不明であった。今回我々は、培養ヒト皮膚繊維芽細胞を用いて、接着斑におけるアクチン重合活性への、機械的力の影響を調べた。アクチン重合活性は、蛍光標識アクチン分子の接着斑への取り込み量で評価した。ミオシンIIを阻害することで、細胞自身の収縮力による接着斑への力の付加を阻害すると、接着斑でのアクチン重合活性が消失した。ミオシンIIを阻害した状態で、基質を伸展させることにより外部から接着斑へ力を加えると、接着斑でのアクチン重合が回復した。これらの結果は、力の付加が接着斑でのアクチン重合を活性化することを示している。次に、アクチン重合との関わりが示唆されている接着斑タンパク質zyxinについて、力応答性のアクチン重合調節への役割を調べた。zyxinの接着斑への局在は、ミオシンIIの阻害で消失し、基質を伸展させると回復した。すなわち、zyxinの接着斑への局在は力依存的であった。また、zyxinのアミノ末端欠損変異体の発現により内在性zyxinの接着斑への局在を阻害すると、接着斑での力依存的なアクチン重合活性が低下した。これらの結果から、zyxinは力に応答してアクチンの重合を調節するメカノトランスデューサー分子であることが明らかとなった。

なお本研究はJournal of Cell Science誌において注目論文を紹介するIn this issueにて取り上げられました

論文情報

Hiroaki Hirata, Hitoshi Tatsumi and Masahiro Sokabe
Journal of Cell Science 121, 2795-2804 Published by The Company of Biologists 2008
doi:10.1242/jcs.030320

【図１】

機械的力の変化に応答してのzyxinの局在の変化。
A: 正常な繊維芽細胞。zyxinが接着斑に局在している（矢印）。
B: ミオシンIIを阻害し、収縮力の発生を阻害した細胞。zyxinの接着斑への局在が消失している。C: ミオシンIIを阻害した状態で、基質を両矢印の方向に50%伸展させた。zyxinの接着斑への局在が回復している（矢印）。