950KB（ダウンロードできます）実習コース紹介
1. in vitro 発現系を用いたイオンチャネル・受容体の機能解析
神経機能素子研究部門
イオンチャネル・チャネル型受容体・代謝型受容体等の膜機能蛋白を、アフリカツメガエル卵母細胞、HEK293細胞等のin vitro発現系を用いて発現させ、その分子機能と細胞応答を、2本刺し膜電位固定法、パッチクランプ法、細胞内Ca2+ イメージング法、FRET法に基づいた分子プローブによるcAMP解析法などにより記録するトレーニングを行う。データの解析法や実験の統合的な進め方についてのトレーニングも行う。少人数制とし、マンツーマンに近い形での指導を行う。電気生理学の初心者、分子生物学の初心者も歓迎し、各自の希望に沿えるよう、可能な範囲で個別対応も行う。
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2. 組織からの蛋白質複合体精製と質量分析による蛋白質同定
生体膜研究部門
脳の複雑かつ精緻な活動を支える脳細胞（神経細胞・グリア細胞）の働きは、個々の細胞が保有する多種の蛋白質の機能によって成立します。イオンチャネルや受容体、シグナル分子、酵素などの機能蛋白質は、適材適所で互いに相互作用し蛋白質複合体を形成して、ユニットとして機能します。したがって、これら蛋白質相互作用を生化学 的に同定することは、脳機能を理解する上で必須です。本コースでは、脳組織からの 免疫沈降法により、特定の蛋白質を含む生理的な蛋白質複合体を精製し、質量分析装置を用いて、複合体構成分子を同定するまでを実習します。生化学実験の経験は必須ではありませんが、精製から同定までほとんどの実験操作を実際に受講者自身に行っていただきます。短期間集中的に行いますので、若干ハードワークなコースとなります。
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3. in situ hybridization法
分子神経生理研究部門
Allen Brain AtlasおよびGENSATの整備により、マウス脳の胎生期から成体期にいたるまで興味のある遺伝子の発現分布を知ることが出来る。大まかに遺伝子発現分布を知るにはこれらのデータベースは強力なツールであるが、何か特殊な操作後の遺伝子発現変化には一切対応していない。そういった目的では研究者自らがin situ hybridization法を行う必要がある。本トレーニングコースでは成体マウス脳切片を用いて、in situ hybridization法を行い、特定のmRNAの脳内分布を描出し観察する。更に、免疫組織化学とin situ hybridization法を組み合わせ、mRNAと抗原（GFAPなどのマーカータンパク）を同一切片で可視化する方法を指導する。
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4. 免疫電子顕微鏡法
脳形態解析研究部門
生体のはたらきを知るためには、まずその構造を知り、機能分子がその構造の中でいかなる分布、局在、動態を示すかを知ることが、基本的に重要である。電子顕微鏡レベルで分子の局在を可視化するためには、特殊な例を除き、特定の分子を選択的に、且つできるだけ高解像度で標識することが必要となる。免疫電子顕微鏡法（免疫電顕法）とは、超微形態レベルで抗原分子の局在を特異抗体を用いて観察する免疫組織化学法のことである。免疫電顕法としては酵素抗体法、酵素抗原法、金属標識抗体法、放射製同位元素標識法などがあるが、本コースでは神経科学で広く使われている酵素抗体法と金属標識抗体法を、神経伝達物質受容体の局在解析を例として紹介する。
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5. ジーンターゲティングマウス作製の基礎から応用へ
遺伝子改変動物作製室
マウスでは、生殖細胞への分化能を持ったES細胞レベルで、標的遺伝子組み換えを施し、その組み換えES細胞を受精卵へインジェクションすることで、標的遺伝子の配列を自由自在に改変させた個体を作り出すことができる。分子生物学的手法と発生工学的手法を駆使して作製するこの手法は、マウスにおけるジーンターゲティング法と呼ばれており、ヒト疾患の発症メカニズムや脳神経機能の分子メカニズムを解明するのに大いに役立っている。本コースでは、マウスにおける、1) ES細胞培養の基礎、2) 実験動物の取り扱い、3) 受精卵の採取（過剰排卵誘起、卵管・子宮灌流）、4) 受精卵の顕微操作（8-cellインジェクション）、5) 胚移植（胚の子宮内移植）といった発生工学の基本技術について実習する。
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6. パッチクランプ法
細胞生理研究部門
パッチクランプ法による実際の電流記録と活動電位の関連を基礎から学ぶことができます。全細胞記録法を用いて神経細胞上で実際に発生する活動電位を記録し、その背景にある膜電位依存性Na+及びK+イオンチャネルの活動を膜電位固定下で記録します。それらの実際の膜電位依存性を電流・電圧曲線を描いて分析することにより、活動電位の発生機構を理解します。こうした基本法を修得した後、培養細胞に非選択性陽イオンチャネルの温度感受性TRPチャネルを強制発現させてその機能解析を学びます。具体的には、培養感覚神経細胞や温度感受性TRPチャネルを強制発現させたHEK293細胞を用いて温度変化による電流活性化をパッチクランプ法によって観察します。温度と電流情報を同時に取り込み、電流の温度依存曲線を作成します。
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7-1. スライスパッチクランプ法
神経シグナル研究部門
大脳神経回路論研究部門
パッチクランプ実験の初心者を主な対象として、脳スライス標本の作製手順、細胞の選別法、ホールセル記録の基本的手技を指導する。本コースは、パッチクランプ実験の原理を理解するとともに、スライスパッチクランプ法を各自の研究目的に即して実際に適用できるようになることを目標とする。実習では、マウスやラットの脳スライス標本（大脳皮質・小脳・海馬など）を作製し、current clamp法ならびにvoltage clamp法を用いてニューロンの発火活動やシナプス電流を記録する。また、データの解析方法についても概説する。希望者には、記録した細胞を可視化して形態を観察する方法（バイオサイチン染色法）も併せて指導する。染色法の受講希望者は、オンライン申し込みフォームの備考欄に『バイオサイチン染色法受講希望』と必ず明記してください（ただし、染色法受講者はパッチクランプ記録やデータ解析を体験する時間が減ることにご留意ください）。
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7-2. スライスおよびin vivoブラインドパッチクランプ法
神経シグナル研究部門
脊髄後角や脳幹青斑核のスライス標本を用いてブラインドホールセルパッチクランプ記録の実習を行い、感覚伝達、特に痛みをテーマとしてカプサイシンなどTRP受容体作動薬のシナプス前性の作用解析、また、希望者にはin vivoパッチクランプ法を用いた感覚シナプス応答記録の実習も行う。本コースで用いるブラインドパッチクランプ法は、細胞を視認する必要がないために高価な顕微鏡が不要であり設備投資が低く抑えられること、また、組織表面のみならず深部に位置する神経核やミエリンが発達し可視化が困難な成熟した動物、作製に日数を要するモデル動物を対象にできるなどの長所を有す。ブラインドパッチクランプ記録法を取り入れた統合的な感覚伝達機構解析法の習得を目的とする。
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8. ゼブラフィッシュを用いた神経回路機能の解析
神経分化研究部門
ゼブラフィッシュは、胚期、幼期を通して体がほとんど透明であり、蛍光タンパク質を用いて神経細胞を生きたまま高精度に可視化できる。本トレーニングコースでは、この長所を実際に受講者にふれてもらうことを第一義の目的として以下の実験を行う。 （１）DNAコンストラクトの胚への注入と、GFP発現細胞の観察： 当方で用意したDNAコンストラクトを一細胞期の胚に注入する。１―３日後に、ラベルされた神経細胞の形態を共焦点顕微鏡で観察する。 （２）カルシウムイメージング： 遺伝学的にコードされたカルシウムインディケーターG-CaMPを脊髄神経細胞へ発現させ、幼魚の行動に伴う神経活動をカルシウムイメージングによってモニターする。 （３）幼魚の神経細胞からの電気生理学的記録： GFP、および、ChR2でラベルされた脊髄神経細胞からの、仮想遊泳行動中の電気生理学的な記録を紹介する（講師によって行われる）。また、ChR2（光によって活性化する陽イオンチャネル）発現細胞においての、光によるスパイク誘発を確認する。
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9. 色と質感知覚の脳内メカニズムの実験的解析
感覚認知情報研究部門
知覚のメカニズムを理解するためには、知覚のもとになる外界に生じた物理的な現象と、心理的な現象として生じる知覚の内容と、それらを媒介する脳内神経活動の３者の関係を明らかにしていくことが必要です。このコースでは当研究室が行っている色と質感知覚の研究を具体的にとりあげて、このような研究の考え方を学び、研究を行う基礎となる脳活動計測（電気生理およびｆＭＲＩ計測）実験および心理物理実験の実習を行います。脳活動計測実験では、微小電極法およびｆＭＲＩを用いてサルの視覚皮質から脳活動を記録する実験を体験し、実験目的の設定、課題や刺激のデザイン、記録に必要なシステムについて理解を深めます。また色や質感の知覚に関わる物理的な要因の理解をはかるとともに、色や質感知覚をどのように客観的に測定するかについての心理物理学的実験法の考え方や方法について学びます。本コースは色と質感知覚の研究に焦点を絞ったコースであり、このような分野でこれから研究を行いたいと考えている大学院生、若手研究者を歓迎します。
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10. 脳磁図によるヒト脳機能研究の基礎
感覚運動調節研究部門
初日午前は、脳磁図の原理や測定方法などの基本的事項を講義、実習にあたっての注意事項を確認する。午後から三日目にかけて、体性感覚、聴覚、視覚のそれぞれの分野について、実際に脳磁図の実験を行う。参加者は、脳磁図データの測定や被験者を体験する。実際に測定したデータを用いて、種々の解析を行う。最終日の金曜日は、参加者が希望する実験を行う。これにより、脳磁図に向く実験やパラダイムについての理解を深める。以下にそれぞれの分野の概略を述べる。体性感覚：手（正中神経）および足（後頸骨神経）の刺激による最初の大脳活動（中心後回の3b野）を記録する。体部位再現に矛盾のない部位に活動がみられるか、手と足の刺激で反応潜時に差があるかなどを検討する。聴覚：ヒトが音を聴取した際に記録される脳磁場反応の発生源や刺激音の周波数情報に依存する聴覚野の局在を確認することを目的する。視覚：視覚実験では、特に研究対象となる機能的部位により刺激の選択が大変重要となる。今回の実習では、比較的簡単な刺激から高次視覚情報処理を観察するための特殊な刺激まで、いくつかの刺激を紹介しながら、実際に記録される波形を分析しその結果について検討していきたい。
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11. ヒト脳機能マッピングにおけるデータ解析入門
心理生理学研究部門
機能的磁気共鳴画像法(functional MRI)に代表される脳機能画像法の発達により、人体を傷つけることなく脳活動を可視化出来るようになった。得られたデータの解析には画像処理や統計学的手法の応用が不可欠であるが、SPMを代表とする解析パッケージが容易に手に入ることもあり、その中身を理解しなくとも簡単に結果が得られる状況にある。データ処理手法は近年ますます高度化・複雑化し、初学者が独学で理解するには難しい面もあるが、誤った取扱い(安直な実験課題作成や不適切な解析、誤った解釈など)は、真実からかけ離れた結論を導き出しかねず、注意が必要である。本コースは、脳機能画像解析の初級編と位置づけ、主に画像データの前処理および統計解析（個人解析・集団解析）の理論と実際について、機能的MRIデータを教材とした講義と実習を行う（MRIを使った撮像実習は行わない）。これらを通して脳機能画像法のもつ可能性とピットホールについてバランスのとれた理解を深められるようにする。SPMを作動させるにはMathworks社製のソフトウェアであるMATLABが必須である。受講に当たってはspm8が作動するMatlab7.1 (R14SP3) か、それより新しいバージョンをインストールしたノートパソコンを持参することが必須である（ネットワークライセンスは不可）。本コースでは統計の基礎知識を持っていることを前提としており、T検定・分散分析・相関の原理と実際について予習が必要である（参考文献：心理学のためのデータ解析テクニカルブック・一般線形モデルによる生物科学のための現代統計学等）。またエクセルによるデータの基本的な操作ができることが望ましい。
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12-1. 生理学実験のための電気回路・機械工作・プログラミング(1)
（生体アンプとバスチェンバーの作製）
技術課
本実習コースは、電気回路工作・機械工作実習を通して研究を進める上での「も の作り」の大切さを知ることを目的としています。電気回路工作では、生体アン プの作製を通して回路設計の基本、回路図の読み方、はんだ付け技術の習得を目 指します。また生体信号の計測をLabVIEWを用いて体験し、計測・制御の理解を 深めます。機械工作では、アクリル製バスチェンバーの作製を通して機械設計の ポイント、材料の選択、加工手順、縦フライス、旋盤、ボール盤等の工作機械の 使用法を習得します。本実習コースは、一人の方が最初から完成まですべて行 う、より実践型の実習であることを特長としています。
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12-2. 生理学実験のための電気回路・機械工作・プログラミング(2)
（Ｃ言語によるＰＩＣプログラミング）
技術課
種々の実験の制御や計測に応用可能なPIC(Peripheral Interface Controller)を 取り上げ，PICを応用するためのハードウェアとソフトウェアの基礎を学びま す。ハードウェア実習ではPIC本体の構成と機能ならびに周辺部品の概要を学 び，「PICマイコン学習キット」の作製を行います。ソフトウェア実習では，C言 語のプログラミングの基礎を学習し，PICを制御するためのプログラムを作成し ます。作成したプログラムは，PICライタにて書き込みを行い，先に作製した 「PICマイコン学習キット」を使って動作確認を行います。このような実践型の 実習を通し，生理学実験に必要となる実験機器の製作技術の基本と応用力の養成 を目的とします。
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13. 電子顕微鏡トモグラフィー
形態情報解析室
電子顕微鏡（電顕）トモグラフィーは、試料を連続的に傾斜させて電顕像を収集 し、投影像から三次元構造を再構築する方法である。本コースでは、１）電顕ト モグラフィーの理論と電顕の使い方、２）連続傾斜像の撮影の仕方、３）画像の 解析およびトモグラムの計算方法、４）得られた三次元像に輪郭を加えてプレゼ ンテーション用の図にしたり、ムービーを作成したりする方法までを実習しま す。そして最終日に、各自の作品の発表会を行います。トモグラフィー解析およ びフィギャーの作成には、フリーのソフトウエアを使用し、基本的に各自で持参 のラップトップコンピュータを使って行います。また、コース期間中に、参加者 どうしの研究紹介を行い、研究交流も深めたいと思います。