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実習コース紹介

1. 海馬神経初代培養法とシナプス超解像イメージング

生体膜研究部門

海馬神経初代培養法は、神経細胞の分化(軸索・樹状突起形成、シナプス発達)やシナプス可塑性を解析するために有用な手法として広く行われるようになっている。しかし、多様なファクターが培養の成否に関与するため、良質で長期間安定な培養を再現性高くおこなうことが難しいことも多い。本コースでは、比較的簡便で失敗しにくいラット海馬神経初代培養法を体験する。免疫染色、生細胞観察、生化学、電気生理実験いずれにも対応可能な方法であり、本コースでは、初代培養神経細胞への遺伝子導入法と神経細胞の免疫染色法、シナプスの超解像顕微鏡観察も体験する。通常の細胞培養の経験があることが望ましい。

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2. in situ hybridization法

分子神経生理研究部門

定量的PCR法の普及により、生体組織における各種遺伝子の発現変化を調べることが容易になった。しかしながら注目する遺伝子が、どの細胞種に局在しているか、その発現分布を調べるにはin situ hybridization法を行う必要がある。当該トレーニングコースでは成体マウス脳切片を用いてin situ hybridization法を行い、特定のmRNAの脳内発現分布を観察する。さらに、免疫組織化学とin situ hybridization法を併用することにより、注目するmRNAとマーカータンパク質とを、同一切片内で検出する方法を指導する。

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3. ジーンターゲティングマウス作製の基礎から応用へ

遺伝子改変動物作製室

マウスでは、生殖細胞への分化能を持ったES細胞レベルで、標的遺伝子組み換えを施し、その組み換えES細胞を受精卵へインジェクションすることで、標的遺伝子の配列を自由自在に改変させた個体を作り出すことができる。分子生物学的手法と発生工学的手法を駆使して作製するこの手法は、マウスにおけるジーンターゲティング法と呼ばれており、ヒト疾患の発症メカニズムや脳神経機能の分子メカニズムを解明するのに大いに役立っている。本コースでは、マウスにおける、1) ES細胞培養の基礎、2) 実験動物の取り扱い、3) 受精卵の採取(過剰排卵誘起、卵管・子宮灌流)、4) 受精卵の顕微操作(8-cellインジェクション)、5) 胚移植(胚の子宮内移植)といった発生工学の基本技術について実習する。

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4. 2光子顕微鏡による細胞内分子活性化のFRETイメージング

多光子顕微鏡室

二光子顕微鏡法は生体組織深部のイメージングに適しており、高空間分解能での蛍光観察や局所的な細胞刺激を可能にする最新の手法である。さらにこの顕微鏡を用いたFRETイメージングによって、組織深部の細胞内の分子活性化を観察することができるため、細胞のいつ、どこで、どのような分子が働いているのかといった情報を知ることも可能になっている。本実習では2光子蛍光顕微鏡やFRETについての基本的な知識を習得する。また、実際にラット海馬スライスの神経細胞や培養細胞(HeLa)にFRETセンサーを遺伝子導入(遺伝子銃、リポフェクション)し、細胞への入力刺激時のシグナル伝達分子(CaMKII)の活性化イメージングを行う。さらに得られたデータの解析をMatlabを用いて行う。

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5. TEMトモグラフィーおよび連続ブロック表面SEMによる細胞の三次元形態解析

形態情報解析室

TEMトモグラフィーおよび連続ブロック表面SEMによる細胞や細胞小器官などの三次元構造解析を実習する。TEMトモグラフィーは、透過型電子顕微鏡 (TEM)を用いて試料を連続的に傾斜させて画像を収集し、投影像から三次元構造を再構築する方法である。また連続ブロック表面SEMは、樹脂包埋された 試料を連続的に削りながらその表面に現れる構造を走査型電子顕微鏡(SEM)により記録し、試料の三次元構造を再構築する方法である。本コースでは、 それぞれのその装置の試料作製法、操作方法、データ収集法、三次元再構成法、三次元像のセグメンテーション法を解説と実習により習得する。

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6. 2光子励起顕微鏡による生体内微細構造・細胞活動イメージング

生体恒常機能発達機構研究部門

非線形工学系である2光子励起法は、長波長のレーザー光を用いて組織内深部構造をミクロンレベルの高解像度で観察する技術です。この高い深部到達度・高解像度・低侵襲の特性を有する2光子法を用いて、脳神経細胞、グリア、骨細胞や血管などの微細構造を生きた動物(マウス)において観察するイメージング技術や、カルシウム指示薬を用いて生体内における神経細胞の活動を測定する技術を提供します。加えて、脳内微細構造イメージングのために頭蓋骨をカバーガラスに置換する技術のトレーニングを行います。

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7. in vitro 発現系を用いたイオンチャネル・受容体の機能解析

神経機能素子研究部門

イオンチャネル・チャネル型受容体・代謝型受容体等の膜機能蛋白を、アフリカツメガエル卵母細胞、HEK293細胞等のin vitro発現系を用いて発現させ、その分子機能と細胞応答を、2本刺し膜電位固定法、パッチクランプ法、細胞内Ca2+ イメージング法、FRET法に基づいた分子プローブによるcAMP解析法などにより記録するトレーニングを行う。データの解析法や実験の統合的な進め方についてのトレーニングも行う。少人数制とし、マンツーマンに近い形での指導を行う。電気生理学の初心者、分子生物学の初心者も歓迎し、各自の希望に沿えるよう、可能な範囲で個別対応も行う。

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8. パッチクランプ法

細胞生理研究部門
生体恒常機能発達機構研究部門

パッチクランプ法による実際の電流記録と活動電位の関連を基礎から学ぶことができます。全細胞記録法を用いて神経細胞に発生する活動電位を記録し、その背景にある膜電位依存性Na+及びK+イオンチャネルの活動を膜電位固定下で記録します。こうした基本法を修得した後、以下のような応用技術を学びます。
1) 細胞内情報伝達関連分子をintactに保ったまま、イオンチャネルなどの各種細胞センサー活動を観察できる穿孔パッチ法を利用して、受容体?イオンチャネルの細胞内クロストークおよび神経細胞本来のGABA応答や細胞内Cl-濃度調節機構を観察する技術/応用を習得します。

2) 非選択性陽イオンチャネルで高いCa2+透過性を有する温度感受性TRPチャネルの機能解析を学びます。温度感受性TRPチャネルを強制発現させたHEK293細胞を用いて温度変化による電流活性化をパッチクランプ法によって観察します。

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9. スライスパッチクランプ法

神経シグナル研究部門
大脳神経回路論研究部門
視覚情報処理部門

パッチクランプ実験の初心者を主な対象として、脳スライス標本の作製手順、細胞の選別法、ホールセル記録の基本的手技を指導する。本コースは、パッチクランプ実験の原理を理解するとともに、スライスパッチクランプ法を各自の研究目的に即して実際に適用できるようになることを目標とする。実習では、マウスやラットの脳スライス標本(大脳皮質・小脳・海馬など)を作製し、current clamp法ならびにvoltage clamp法を用いてニューロンの発火活動やシナプス電流を記録する。また、データの解析方法についても概説する。希望者には、記録した細胞を可視化して形態を観察する方法(バイオサイチン染色法)も併せて指導する。染色法の受講希望者は、オンライン申し込みフォームの備考欄に『バイオサイチン染色法受講希望』と必ず明記してください(ただし、染色法受講者はパッチクランプ記録やデータ解析を体験する時間が減ることにご留意ください)。また、受講を希望する部門があれば部門名を明記してください。

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10. In vivoおよびスライスブラインドパッチクランプ法

神経シグナル研究部門

病態モデルや遺伝子操作動物における行動異常の成因などを単一ニューロンやシナプスレベルで機能解析する、in vivoパッチクランプ法やスライスパッチクランプ法の実習を行います。感覚伝達、特に痛みなどをテーマとし、スライス標本を用いたカプサイシンなどTRP受容体作動薬のシナプス前性の作用解析、希望者にはin vivoパッチクランプ法による生理的な感覚刺激によって誘起されるシナプス応答や活動電位の記録・解析の実習を予定しています。本コースで用いるブラインド法は、記録細胞を視認する必要がないために高価な顕微鏡が不要であり設備投資が低く抑えられること、また、組織表面のみならず深部に位置する神経核やミエリンが発達し可視化が困難な成熟した動物、作製に日数を要するモデル動物を対象にできるなどの長所があります。電気生理学の基礎のミニ講義やディスカッションなども予定しています。

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11. 神経性代謝調節研究法入門

生殖・内分泌系発達機構研究部門

近年、分子生物学的手法および遺伝子工学的手法の進展により、迅速で多様な研究成果が得られるようになったが、生体における生理学的意義や全身の代謝調節を検討する為には細胞や臓器レベルだけでなく、各臓器間の相互依存性ならびに脳神経系と他臓器との代謝相関を調べることが必要であり、個体まるごとを使った実験が不可欠である。
我々の研究室では、中枢神経系特に視床下部における摂食行動、糖・脂質代謝への調節機構を明らかにするため、マウス視床下部の各神経核をレプチンや様々な生理活性物質によって刺激あるいは抑制し、摂食行動の変化や各末梢組織における糖および脂質の代謝動態を測定、解析している。そのため、視床下部への神経伝達物質の投与、代謝産物の血中濃度測定のための採血などを、無麻酔・非拘束下の実験動物を用いて実施している。
そこで本コースにおいては、視床下部に神経伝達物質を投与するための微小カニューレの正確な挿入と固定手術の習得を目指し、その後無麻酔・非拘束下において、自身で留置した微小カニューレより生理活性物質を実際に投与し、摂食行動を観察する。さらに実験動物の内分泌代謝機能は実験環境によって非常に鋭敏に変化するため、あらかじめ実験動物を実験時の状態に慣れさせておく必要がある。そこで、実験動物のハンドリングの"コツ"の習得も併せて行う。

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12. 視知覚の脳内メカニズムの実験的解析

感覚認知情報研究部門

視知覚の神経機構を明らかにするためには、ある視知覚が生じている時に大脳皮質視覚野においてどのようなニューロン活動が生じ、視知覚の変化に伴ってこのニューロン活動がどのように変化するのかを調べる必要があります。本コースではこのような研究の考え方を学び、研究を行う基礎となる脳活動計測実験および心理物理実験の実習を行います。脳活動計測実験では、当研究室で行われている微小電極法を用いてサルの視覚皮質から脳活動を記録する実験を体験することにより、実験目的の設定、課題や刺激のデザイン、記録に必要なシステムについて理解を深めます。一方、知覚そのものを客観的に測定する方法を理解するために、パソコン上に作成し呈示する視覚刺激を用いた心理物理実験を体験し、さらに知覚とニューロン活動を対応付ける方法について学びます。本コースは視知覚の研究にしぼって第一線の研究を初心者に分かりやすく体験してもらうことを目的としています。将来、この分野の研究に関わりたいと考えている大学院生、若手研究者を歓迎します。

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13. 行動下動物での実験・データ解析の基礎

認知行動発達機構研究部門

従来、刺入電極を神経活動記録法は、脳に対する侵襲度が高く、長期の安定的な記録の維持に問題がある。一方、臨床では、脳表面に慢性的に留置されたシート状の電極から計測されるElectrocorticography(ECoG)が難知性てんかんを有する患者の治療・検査に用いられてきたが、そのECoGが基礎研究においても低 侵襲で、時間分解能の高い更に、慢性留置が可能な脳活動の記録方法として現在注目を浴びるようになってきた。本トレーニングコースでは、覚醒行動下の動物の皮質表面から多チャンネルでECoGを記録し、解析方法について実習する。動物実験・電気生理学の未経験者初心者も歓迎する。

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14. 慢性動物実験法入門

生体システム研究部門

覚醒下の実験動物に様々な課題を遂行させ、その際の神経活動を記録・解析するという「慢性実験」は、神経回路が実際に生体内でどのように働いているのかを解明する強力な手段です。慢性実験は主に霊長類を用いた実験手技として発達・洗練されてきたのですが、げっ歯類にも応用可能で、とくに遺伝子改変動物を用いたin vivo記録は、物質と行動との間をつなぐ重要なステップです。また、慢性実験は覚醒下で行うため、麻酔の影響を排除することや、繰り返し同一の実験動物を使うことが可能です。さらに従来の急性実験の手法を用い、様々な脳領域に刺激電極を留置し電気生理学的に神経回路を解析することや、脳局所への薬物注入による行動変化なども観察することができます。しかし、このような実験技術は各研究室で手から手へと受け継がれることが多く、なかなか体系だって習得する機会が少ないのが現状です。本コースでは、このような慢性実験を始めたばかり、あるいはこれから始めようとする研究者や大学院生を対象に、実験動物からの神経活動記録、金属電極作成、実験に必要なハードウエアやソフトウエアなど、基本的な技術習得を目指して実習を行います。

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15. 脳磁図によるヒト脳機能研究の基礎

感覚運動調節研究部門

脳磁図(MEG)は、脳の神経活動に伴って発生する磁場(磁界)を頭皮上から非侵襲的に計測する技術です。初日の講義で脳磁図の原理や測定方法などの基本的事項や実習にあたっての注意事項を確認した後、体性感覚・聴覚・視覚それぞれの感覚系について、脳磁図計測の実習を行います。参加者は被験者を体験し、脳磁図データの測定や測定したデータの解析を行います。例えば体性感覚系では、正中神経刺激による最初の大脳活動(およそ20ミリ秒)を記録し、信号源推定を試みます。脳磁図の時間・空間分解能がある程度体感できると思います。後半の1〜2日は、参加者が希望する実験を行う予定です。これにより、脳磁図に適する実験やパラダイムについての理解が深まると期待されます。予め担当者から希望する実験について連絡があります。

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16. ヒト脳機能マッピングにおけるデータ解析入門
   (別途アンケート回答の必要あり)

心理生理学研究部門

本コースでは脳機能画像解析の初級者を対象に、機能的MRIデータの前処理と統計解析について、講義およびSPM12(b)による実習を行う。受講に当たってはMATLAB 7.4 (R2007a)~8.3 (R2014a)のうちいずれかのバージョンをインストールしたノートPCを持参する必要がある(ネットワークライセンスは不可)。講義の理解には高度な統計知識(一般線形モデル)を必要とする。参加希望者はオンライン登録とは別に次の4項目に対する回答を募集締切日までにkitada[at]nips.ac.jp(atを@に変換)まで送ること。①主たる実験者としてfMRI実験を実施する予定の有無 ②fMRI画像解析の経験年数 ③PC操作技術の有無(MATLABを一人でインストールできる程度) ④統計の知識と実践(分散分析・重回帰分析)の有無。メールの標題は「2014年TC参加アンケート回答」とすること。

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17. 心臓の圧受容・適応シグナル評価法

心循環シグナル研究部門

心臓は、血行力学的負荷の強さに応じて自身の収縮力を高めることで、ポンプ機能を維持している。しかし、何らかの原因で心臓に血液が滞留し、慢性的な容量負荷が心臓に加わると、心臓は負荷に十分適応できず、やがて心不全を引き起こす。つまり、力学負荷に対する心臓の適応原理を理解することが、心不全治療戦略の基盤となる。 心臓の力学負荷に対する応答は、分子→細胞→組織とすべての次元における現象の総和として個体に反映される。本コースでは、最初に個体レベルでの心機能測定法の原理と評価方法について学んでいただく。次に、摘出心臓を用いた心機能測定を実習し、圧負荷に対する心筋適応・不適応を観察していただく。さらに、初代培養心筋細 胞のメカニカルストレスに応答した細胞内カルシウム濃度測定や分子間相互作用の光学的検出法を実習することで、心筋の圧受容・適応シグナルの評価技術を学んでいただく。

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18-1. 生理学実験のための電気回路・機械工作・プログラミング(1)
   (生体アンプとバスチェンバーの作製)

技術課

本実習コースは、電気回路工作・機械工作実習を通して研究を進める上での「もの作り」の大切さを知ることを目的としています。電気回路工作では、生体アンプ(EMG)の作製を通して回路設計の基本、回路図の読み方、はんだ付け技術の習得を目指します。機械工作では、アクリル製バスチェンバーの作製を通して機械設計のポイント、材料の選択、加工手順、縦フライス、旋盤、ボール盤等の工作機械の使用法を習得します。本実習コースは、一人の方が最初から完成まですべて行う、より実践型の実習であることを特長としています。

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18-2. 生理学実験のための電気回路・機械工作・プログラミング(2)
   (C言語によるPICプログラミング)

技術課

種々の実験の制御や計測に応用可能なPIC(Peripheral Interface Controller)を取り上げ,PICを応用するためのハードウェアとソフトウェアの基礎を学びます。ハードウェア実習ではPIC本体の構成と機能ならびに周辺部品の概要を学び,「PICマイコン学習キット」の作製を行います。ソフトウェア実習では,C言語のプログラミングの基礎を学習し,PICを制御するためのプログラムを作成します。作成したプログラムは,PICライタにて書き込みを行い,先に作製した「PICマイコン学習キット」を使って動作確認を行います。このような実践型の実習を通し,生理学実験に必要となる実験機器の製作技術の基本と応用力の養成を目的とします。

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