分子生理研究系
神経機能素子研究部門
【概要】
イオンチャネル，受容体，G蛋白質等の膜関連蛋白は，神経細胞の興奮性とその調節に重要な役割を果たし，脳機能を支えている。本研究部門では，これらの神経機能素子を対象として，生物物理学的興味から「その精妙な分子機能のメカニズムと動的構造機能連関についての研究」に取り組み，また，神経科学的興味から「各素子の持つ特性の脳神経系における機能的意義を知るための個体・スライスレベルでの研究」を進めている。
今年度，これまでに引き続き，神経機能素子の遺伝子の単離，変異体の作成，tagの付加等を進め，卵母細胞，HEK293細胞等の遺伝子発現系における機能発現の再構成を行った。また，2本刺し膜電位固定法，パッチクランプ等の電気生理学的手法，細胞内Ca2+イメージング・全反射照明下でのFRET計測等の光生理学的手法，細胞生物学的研究手法により，その分子機能調節と構造機能連関の解析を行った。また，外部研究室との連携により，精製レコンビナント蛋白を用いた単粒子構造解析，遺伝子改変マウスの作成も継続して進めている。以下に今年度行った研究課題とその内容の要約を記す。
スプライシングの違いにより同一遺伝子から作られる
新規代謝型受容体蛋白と分泌蛋白の発現解析
久保義弘，山本友美
我々は，遺伝子データベースの検索により，スプライシングの違いにより同一遺伝子から，オーファン受容体(Long-Prrt3)と，そのN末端の細胞外部分のみからなる分泌蛋白(Short-Prrt3)の両方がつくられる機能未知の新規分子Prrt3を見出した。今年度，これらの蛋白のマウスにおける発現分布を解析した。Long-Prrt3を認識する抗体により免疫染色したところ，脳内では小脳プルキンエ細胞層直下のcerebeller pinceauと呼ばれるbasket細胞のシナプス前終末がある部分に発現がみられた。また，正中隆起の表面に存在する下垂体隆起葉において強い発現が見られた。Short-Prrt3を認識する抗体によりその発現を解析したところ，脳室の脈絡膜上皮細胞にほぼ限定して発現が観察された。さらに，マウス脳脊髄液を採取してWestern blotを行ったところ発現が検出された。
サブユニット間相互作用による代謝型グルタミン酸受容体の機能制御機構
立山充博，久保義弘
代謝型グルタミン酸受容体I型(mGlu1a)は，複数のG蛋白質(Gs, Gq, Gi)と共役して多様な細胞応答をもたらすことが知られている。mGluR1はホモ二量体で構成されるが，mGluR1サブユニットの一つがグルタミン酸に結合すると，そのサブユニット（シス型）のみならずもう一方のサブユニット（トランス型）によってもGq蛋白質が活性化された。それに対しGi/o経路は，シス型単独でもトランス型単独でも活性化されないことが明らかになった。さらに，一方のサブユニットにG蛋白質との共役を抑制する変異を導入することによっても，同様の結果が得られた。mGluR1を介する多様なシグナル伝達経路は受容体サブユニット間の相互作用により制御されるという可能性が示唆された。
ホヤKCNQ1ホモログを用いたKCNE1によるKCNQ1機能調節機構の探索
中條浩一，久保義弘
西野敦雄（大阪大学大学院理学研究科）
岡村康司（大阪大学大学院医学系研究科・生命機能研究科）
電位依存性K+チャネルKCNQ1はKCNE1の結合によってその電流の性質を大きく変える。ユウレイボヤゲノムにはKCNE1に相当する遺伝子が存在しないため，Ci-KCNQ1はKCNE1による調節を受けないことが想定され，そうであれば，ヒトKCNQ1チャネル上で，KCNE1による調節を受けるために重要な部位を同定できると考えた。実際Ci-KCNQ1はKCNE1によって引き起こされる電位依存性のポジティブ電位方向へのシフトが見られなかった。そこで電位依存性のシフトを指標として，ヒトとホヤのKCNQ1キメラ変異体，点変異体の作成により，KCNE1による機能調節に重要な箇所の同定を試みた。その結果，ヒトKCNQ1上のS5セグメントのグリシン，S6ドメインの2つのバリンが重要な役割を担っていることがわかった。同定したアミノ酸をKCNQ1の構造モデルにマッピングすると，すべてタンパク質の外側，すなわち細胞膜側に向かっていた。
代謝型グルタミン酸受容体mGluR1とSTIM1の相互作用の解析
伊藤政之，久保義弘
小脳プルキンエ細胞で見られるmGluR1によって活性化されるslow EPSCはmGluR1とTRPC1またはTRPC3の複合体によるものであることが知られている。一方，STIM1はTRPCファミリーのストア作動性チャネルとして機能に重要な分子として近年注目されている。そこでSTIM1のmGluR1-TRPC1またはC3複合体に対する作用を明らかにするため，mGluR1と直接相互作用するのか解析を行った。in vitroの発現系を用いた免疫沈降法によりmGluR1-STIM1の相互作用が検出された。またSTIM1は，mGluR2とは結合するが，GABAB受容体とM1受容体にはほとんど結合しないことが分かった。一方，STIM1によるmGluR1の機能修飾について検討を行ったが，有意な差は見られなかった。今後は発現系を用いた実験に加え，プルキンエ細胞で見られるmGluR1-slow EPSCに対するSTIM1の機能阻害抗体の効果の解析等も併せて行い，機能的な意義の解明につなげたい。
TRPA1チャネルの種特異的カフェイン応答に関する機能決定部位の同定
長友克広，久保義弘
我々は，これまでにマウス腸由来神経内分泌細胞STC-1のカフェイン応答に，TRPA1が関与していること，このTRPA1チャネルのカフェイン応答には種差による違いがあり，マウスTRPA1はカフェインにより活性化され，ヒトTRPA1は抑制されることを見いだした。今年度，このカフェイン応答の種差を決定する部位を明らかにするために，マウスとヒトのキメラチャネルを作成し解析を行った。N末端領域を入れ替えたキメラを作成したところ，N末端にそれぞれの機能を決定する部位が存在することが明らかになった。ヒトTRPA1を基本骨子としてマウスのN末端を徐々に短くしていくキメラを作成すると，287A.A.まではカフェインによる活性化が見られたが，230A.A.まで短くするとカフェインによって抑制されるようになった。以上の結果から，機能に重要な部位が231-287A.A.にあることが分かった。
GABAB受容体の活性化にともなうサブユニットの配置変化
松下真一，立山充博，久保義弘
GABAB受容体の活性化時の構造変化を明らかにするために，GABAB受容体を構成する2種のサブユニットGB1aおよびGB2それぞれの細胞内ループに蛍光蛋白を挿入し，リガンドによる活性化にともなうFRET変化を計測した。その結果，GB1aのループ2とGB2のループ1または2との間で分子間FRETの減少が起きることがわかり，これは，mGluR1aの場合の分子間FRET変化とは様式が大きく異なる。これに対して，GB1aとGB2それぞれの内部にFRET pairを導入して分子内FRET変化を計測したところ，各サブユニットにおいて膜貫通部位の動きはほとんど見られず，この点ではmGluR1aの結果と共通している。これらから，Family C受容体におけるシグナル伝達とは，各サブユニットの膜貫通部位の構造変化ではなく，2つのサブユニットの配置状態に大きく依存するものであることが示唆された。
P2X2チャネルの膜電位とATP濃度に依存したゲート機構に役割を果たす
アミノ酸残基の同定
Batu Keceli，久保義弘
ATP受容体チャネルP2X2は，膜電位センサーを有しないが膜電位依存的活性化を示す。今年度，膜電位に依存するゲート機構の構造基盤を明らかにするために変異体解析を行った。(1) ATP結合部位と同定されている領域の変異体の解析を行ったところ，K308RではG-V関係が過分極側に大きくシフトしており，また活性化速度が速かった。(2) ATPによる活性化に関与することが知られている膜貫通部位の細胞外側端の変異体の解析を行ったところ，T339S等は低いATP濃度では遅い膜電位依存的活性化を示し，高いATP濃度では膜電位に依存しない恒常的活性化を示した。(3) 質的に逆向きの変化を与えたK308RとT339Sの2重変異体の解析を行ったところ，野生型に近い性質を示した。以上の実験結果から，P2X2の膜電位依存的ゲートには，ATP- ATP結合部位複合体と膜貫通部位細胞外側端が複合的に寄与していることが示唆された。
KCNK13はプルキンエ細胞におけるGABAB受容体活性化Cs+イオン
透過性K+チャネルの候補の一つである
石井 裕，久保義弘
小脳スライス標本においてプルキンエ細胞のGABAB受容体を活性化すると外向きK+電流が観察される。この電流の解析を行ったところ，Cs+によって阻害されず，GABAB受容体とのカップルがよく知られているGIRK電流ではないことが示唆された。KCNKファミリーにはCs+イオンを透過するチャネルがあるので，データベース上でプルキンエ細胞における発現が示されているKCNK13が候補分子として想定された。電気生理学的解析から，KCNK13電流はGbgサブユニットの共発現・GABAB受容体活性化によって増加し，また，Cs+イオン透過性を示した。以上から，KCNK13が小脳プルキンエ細胞におけるGABAB受容体活性化Cs+透過性K+チャネルの候補の一つであることが示された。
プレスチンの動的構造変化のパッチクランプ - 全反射照明下FRET解析
Kristin Rule（カリフォルニア工科大学），立山充博，久保義弘
内耳外有毛細胞は，速い膜電位変化に追随して細胞長を変えるが，プレスチンがその役割を果たす分子として知られている。我々は，プレスチンを対象として電位依存的構造変化の解析を進めている。C末細胞内領域に蛍光蛋白を付加したプレスチンをHEK細胞に共発現させ，4量体であるプレスチンのサブユニットC末端間のFRETを全反射照明下でモニターした。Bathに高K+液を投与することにより細胞を脱分極させたところ有意なFRETの減少が観察された。このFRETの変化が真に膜電位変化によるものであるかどうかを確定するために，外液交換なしにパッチクランプによる迅速な膜電位コントロール下での全反射照明下-FRET解析を行った。その結果，プレスチンの膜電位依存的構造変化の指標と考えられている非線型容量とよく類似した膜電位レンジ依存性を示すFRETの低下が観察された。
分子神経生理研究部門
【概要】
分子神経生理部門では哺乳類神経系の発生・分化，特に神経上皮細胞（神経幹細胞）からどのようにして全く機能の異なる細胞種（神経細胞，アストロサイト，オリゴデンドロサイトなど）が分化してくるのか，について研究を進めている。また，得られた新しい概念や技術は臨床研究への応用を視野に入れながら，病態の解析にも努力している。
脳神経系では他の組織とは異なり多様性が大である。大げさに言えば，神経細胞は一つ一つが個性を持っており，そのそれぞれについて発生・分化様式を研究しなければならない程である。また，均一であると考えられてきたグリア細胞にも性質の異なる集団が数多く存在することも明らかとなってきた。そのため，他組織の分化研究とは異なり，細胞株や脳細胞の分散培養系を用いた研究ではその本質に迫るには限界がある。われわれはin vitroで得られた結果を絶えずin vivoに戻して解析するだけでなく，神経系の細胞系譜の解析や移動様式の解析をも精力的に行っている。
近年，成人脳内にも神経幹細胞が存在し，神経細胞を再生する能力を有することが明らかとなった。この成人における神経幹細胞数の維持機構についても研究している。
糖蛋白質糖鎖解析法を開発し極めて微量な試料からの構造解析が可能となった。脳内において，新しい糖鎖構造を発見し，その生理学的意義について検討している。
グリア細胞の発生・分化
小野勝彦，竹林浩秀，等 誠司，成瀬雅衣，後藤仁志，稲村直子，臼井紀好，池中一裕
中枢神経系において，神経細胞の多様性は発生期に形成されることが知られている。その一方でグリア細胞の発生メカニズム，発生起源，及び発生期に規定付けられる機能的多様性については未だ不明な点が多い。
本研究室ではグリア細胞の発生を規定する分子としてOlig2転写因子に着目し，グリア細胞の発生・分化機構の解明を試みている。グリア細胞においてOlig2がどのような分子機構で発生・分化を制御するかは未だ不明な点が多い。これらを解明するためにyeast two hybrid法やin vitro pull down法によりOlig2結合蛋白質の解析を進めている。
また，昨年度に引き続き，前脳オリゴデンドロサイトの背側と腹側の境界領域に位置する発生起源についても解析を進めるとともに，小脳オリゴデンドロサイトの発生起源に関しても解析を行っている。
更に，アストロサイトにも発生する場所に応じてサブタイプが存在する可能性を想定し，脊髄をモデルとした解析系の確立をニワトリ胚を用いて行っている。
神経幹細胞の生成と維持
等 誠司，成瀬雅衣，松下雄一，Akhilesh Kumar，石野雄吾，池中一裕
神経幹細胞は全ての神経細胞・グリア細胞の供給源であり，脳の構築に非常に重要であるにもかかわらず，その生成の分子機構は不明な点が多い。本グループは早期胚のepiblastにおいて神経幹細胞の前駆細胞である未分化神経幹細胞の培養に成功し，神経幹細胞の誘導にNotchシグナルの活性化が必須であることを解明した。さらに，Notchシグナルの活性化の初期段階をglial cells missing 1/2 遺伝子が担っていることを明らかにし，詳細な分子機構の解明を進めている。そこで得られた知見をES細胞に適応し，試験管内でのES細胞から神経幹細胞の誘導を試みる。一方，神経幹細胞は成体脳においても一部の領域（海馬や嗅球など）に新生神経細胞を供給し，脳機能維持に必要であることが示唆された。特に，海馬における神経新生は，記憶や学習といった脳の高次機能と関係する可能性が指摘されている。本グループでは，躁うつ病の治療に用いられる気分安定薬が成体脳における神経幹細胞の自己複製能を高めること，それがNotchシグナルの活性化によることを明らかにした。今後は，気分安定薬のNotchシグナルにおける分子標的の同定や，神経幹細胞の増加が気分を安定させるそのメカニズムの解明に取組む。
神経細胞の移動・軸索ガイダンス
小野勝彦，竹林浩秀，稲村直子，臼井紀好，池中一裕
脊髄の組織構築形成をモデルとして，回路網形成と細胞移動の制御機構を解析するために，脊髄の回路網形成および視床網様核の細胞の移動について研究を行った。今までに，一次求心性線維の脊髄内における回路網形成においては，脊髄背外側部で一過性に発現するnetrin 1が抑制的に作用してwaiting periodを形成することを明らかにした。今年度，増田知之博士（福島県立医大）との共同研究から，一次求心性繊維が後根神経節から脊髄背側部まで向かう際にも（つまり脊髄に入る前の段階でも），netrin 1が反発性因子として作用していることを見出した。また，感覚神経の軸索ガイダンスについては，Olig2ノックアウトマウスで感覚ニューロンの軸索ガイダンスの異常がみられ，それが運動ニューロンの欠損によると推測され，詳しい解析を進めている。腹側視床の形成については，発生中の視床網様核において，Zona limitans intrathamica周囲のOlig2陽性細胞から分化したニューロンの局在が，発生が進むにつれて脳室側から外側方向（軟膜側）へと変化していた。このことは，発生中の腹側視床ではニューロンが脳室側から軟膜側へ移動して視床網様核を形成している可能性が考えられ，経時観察による解析を検討している。
グリア細胞の機能と病態
田中謙二，李 海雄，竹林浩秀，清水崇弘，馬 堅妹，池中一裕
グリア細胞の重要な機能の一つにシナプス伝達の調節がある。近年，グルタミン酸とATPがアストロサイトから放出され，シナプス伝達を調節することが提唱されているが，その放出部位，放出頻度など不明な点が多い。名古屋大学（現 東京大学）廣瀬教授の開発したプローブを用いて培養アストロサイトから放出されるグルタミン酸を可視化することに成功した。また名古屋大学 曽我部教授のグループと共同で，ルシフェリン発光を利用し，培養アストロサイトから放出されるATPの可視化にも成功した。これらのイメージングの解析から，ATP刺激によるグルタミン酸放出，グルタミン酸刺激によるATP放出が確認されたが，これらの放出は培養アストロサイトの1～10%の細胞だけで観察されること，その放出時間が数十秒あることなどが分かった。今後は，放出に関わる分子の同定，放出の観察されるアストロサイトの特徴抽出，ATPとグルタミン酸との同時測定が課題となった。
脳におけるＮ-結合型糖鎖の構造決定と機能解析
吉村 武，等 誠司，Akhilesh Kumar，東 幹人，
Senthilkumaran Balasuburan，Jan Sedzik，
伊藤磯子，小池崇子，池中一裕
糖鎖を有する分子は細胞表面や細胞外に存在し，細胞間相互作用やシグナル伝達に深く関わっている。これまでに我々は (1)脳内糖鎖発現パターンが発生時期に劇的に変化すること，(2)いくつかの糖鎖の発現量が顕著に変化すること，(3)シアル酸付加糖鎖の構造解析から，大脳皮質の発達過程において劇的に変化する新規シアル酸糖鎖が存在することを明らかにした。本年度は3種類のHPLCを使ったN-結合型糖鎖の微量解析法を開発し，1mg未満の糖蛋白質から糖鎖構造を決定できるように改良した。この解析法を用いて，生検資料や精製した中枢神経や末梢神経由来の髄鞘の糖鎖構造を決定した。
我々はN-結合型糖鎖解析過程でLewis X糖鎖構造の合成に関わる新規フコース転移酵素(FucT10)を見出した。その機能解析を行い，糖蛋白質糖鎖にフコースを転移することや神経細胞移動に関与することを明らかにした。
細胞内代謝研究部門
【概要】
生命は，環境感知機構と細胞内シグナル機構に支えられた適切な細胞応答で実現されている。本部門では，電気生理学と先端バイオイメージングを用いてイオンチャネルや細胞内シグナル分子の動態を測定し，細胞応答に至るシグナルネットワークの時空間統御機構の解明を目指している。特に細胞の機械刺激感覚（細胞力覚）に注目し，メカノセンサーの分子実体（イオンチャネル・細胞骨格/接着斑など）とその仕組みの解明，および細胞運動や細胞形態調節における役割を調べている。また，破骨細胞におけるプロトンシグナリングや受精におけるNO/Ca2+カルシウムシグナリングに関する基礎的研究を行っている。一方で，神経ステロイドによる記憶促進／虚血傷害保護作用のシグナル機構を調べながら，臨床医学への橋渡し的研究を展開している。
なお細胞内代謝部門は2008年度をもって終了いたしました。これまでの皆様のご指導とご支援に対してスタッフ一同心より感謝申し上げます。
細胞における機械刺激受容機構の研究
曽我部正博，平田宏聡
主要課題の一つは，細胞メカノセンサーの代表格である機械受容(MS)チャネルのゲーティング機構の解析です。今年度は細菌のMSチャネルであるMscLのゲーティング機構について解析しました。これまでにMscLの閉構造は分かっていましたが開構造は謎でした。常時開口していると思われるミュータントはありますが，これを大腸菌に発現すると致死的であるため，大量の開状態MscL蛋白質が得られないためです。そこで我々は開チャネルミュータント蛋白質を試験管合成してその構造を電子顕微鏡で観察し，それを元にMscLゲーティングのモデル（IRISモデル）を提唱しました(Yoshimura et al., PNAS,105(10):4033-4038, 2008)。このモデルを検証するために分子動力学モデルを構成し，MscLがどのようにして膜張力を受容して開口するかの全プロセスをシミュレーションしています(Sawada et al., in preparation)。このモデルは野生型や種々のミュータントの実験結果を良く説明するので，我々はMscLゲーティング機構の究極理解に近づきつつあると思っています（曽我部）。
接着性細胞は細胞内外の力学環境（細胞が発生する収縮力や基質の硬さなど）に応じて細胞骨格や接着構造を変えて最終的に形態の変化を惹起します。しかしこのときの力学環境の感知機構は不明で，最終応答に至るシグナル機構は謎のままです。我々は，力学的負荷により，接着斑でのアクチンの重合が活性化することを発見し，このアクチン重合の活性化には，接着斑タンパク質zyxinの力学的負荷に応答しての接着斑へのリクルートが関わっていることを明らかにしました(Hirata et al., J Cell Sci, 121:2795-2804, 2008)。現在，力学負荷依存的にzyxinと相互作用するタンパク質の同定を進め，接着斑におけるメカノトランスダクション機構を明らかにしようとしています（平田）。
プロトンシグナリング機構の研究
久野みゆき
細プロトンは様々な細胞機能に影響を与える重要なシグナルイオンです。破骨細胞はプロトンポンプ(V-ATPase) によって酸を分泌し骨組織を融解し（骨吸収），骨リモデリングや生体Ca代謝の調節に貢献しています。破骨細胞では骨から溶け出したカルシウム(Ca)に暴露されると骨吸収を抑制するネガティブフィードバック応答が起こり行き過ぎを防いでいますが，そのCa感受機構はよくわかっていません。私達は，これまでに高濃度のCaに暴露されるとV-ATPase活性が抑制されることを見出していましたが，同時にendocytosisが促進されること，この過程がV-ATPaseのブロッカーで抑制されることが明らかにしました。私達はV-ATPaseが細胞内小胞と細胞膜の間を移動して活性を調節しており，Caによって細胞膜から細胞内への移行が促進し酸分泌能が低下することが骨吸収抑制の一端を担っているのではないかと考えています。これらの結果は投稿中で，現在，V-ATPase取り込みに関わる更に詳細なメカニズムを検討しています（久野）。
ウニ卵受精時の一酸化窒素(NO)の増加と受精膜硬化の研究
毛利達磨，曽我部正博
経塚啓一郎（東北大大学院生命科学（附）浅虫海洋生物学研究センター）
ウニ卵受精時の一酸化窒素(NO)増加について卵活性化の引き金なのか，どんな働きがあるのか検討しました。NO増加と内外イオンの関係を調べるために電位固定法とNO感受性蛍光色素によるイメージングとの同時測定を行いました。NO増加は受精の引き金ではなく細胞内カルシウム増加の後に増加することを確認しました。受精膜硬化を抑制することが報告されているCN-やNADPH産生酵素の阻害剤DPIもNO増加を完全に抑制しました。このことからNOの働きとして受精膜硬化が強く示唆されたので，この観点で研究を展開しました。またNO吸収剤PTIOを用いて，NO増加を抑制した時とそうでない時とで酸素消費，Redox変化(NADH/NADPH)，H2O2産生を測定しました。酸素消費を酸素電極で測定したところ，PTIO存在下では全体の酸素消費量はコントロールに比べて減少していました。NADH/NADPHの自家蛍光シグナルもPTIO存在下ではその増加が抑制されました。また酸素消費の原因であるH2O2の産生を蛍光試薬Amplex Redで測定したところ，PTIO存在下ではH2O2の産生は抑制されていました。さらに，PTIO存在下では化学的機械的刺激により受精膜はコントロールに比べて遥かに弱くなっていました。これらのことからNOの役割として受精膜硬化を促進する働きについて論文にまとめ発表しました(Dev Biol, 322; 251-262)（毛利）。
神経ステロイドによる脳虚血障害の保護作用
曽我部正博
近年種々のステロイドホルモンが中枢で合成され，様々な機能を発揮することが分ってきました。特に学習記憶行動の促進やアミロイド・脳虚血による神経障害の保護作用が注目を集めていますが，その分子・シナプス機構は不明です。我々は，海馬スライス標本に膜電位イメージングを適用して，代表的神経ステロイドであるエストロゲンやPREGS，DHEAなどの作用機序を調べています。本年度はDHEAの神経保護作用について解析しました。閉経前の女性は閉経後の女性や同年齢の男性に比べて脳卒中の発症率が低く予後も良好であることが知られています。そこで性ホルモンが脳卒中の予防や予後に効果があると考えられ，事実そうであることが分かっています。しかし何時発症するか分からない脳卒中のために性ホルモンを投与し続けることは危険です。我々は卒中に伴う虚血による神経細胞死が発症後2-7日に亘る遅延性であることに注目し，発症後にステロイド (DHEA) を投与しても神経細胞死を防げるのではないかと考えました。結果は，予想通りで，一過的脳卒中において発症後6時間から48時間の間であれば，DHEAの一回投与で神経細胞死をほぼ完全に防止できることが分かりました (Li, et al., J Cerebral Blood Flow Metabol, 29:287-296, 2009)。この手法が人間にも適用できれば大きな福音です。現在治験の可能性を検討しています（曽我部）。
ナノ形態生理研究部門
【概要】
「構造と機能」という分子生物学のパラダイムは生物の機能が生体高分子，特に蛋白質の独自の構造によって支えられていることを明かにして来た。本部門では細胞内超微小形態を高分解能，高コントラストで観察する新しい電子顕微鏡の開発を背景に細胞の「構造と機能」を研究している。
永山グループは位相差電子顕微鏡の開発と，その応用としてのDNA1分子の塩基配列直読法開発，チャネルを中心とした蛋白質の電子線構造解析，“複雑な”生物試料へのZernike位相差法の応用，脳組織凍結割断レプリカの二重標識法開発を行った。また，位相差低温トモグラフィーの開発と応用を新たに開始した。
物質輸送に関する研究が主眼である村上グループは，南京医科大学と共同研究で漢方薬の唾液分泌促進効果について，摘出ラット唾液腺を用い調査を継続発展した。カソリック大学ローマ校とイエテボリ大学と協力して灌流顎下腺とin situ顎下腺の分泌唾液を比較検討するため，唾液中のペプチド/蛋白の質量分析を開始した。
大橋グループはエンドソーム－ゴルジ細胞内膜系の選別輸送のメカニズムと生理機能の研究を行った。
Aharonov-Bohm効果を応用した位相差電子顕微鏡用位相板の開発
大河原浩，Radostin Danev，永山國昭
昨年に続き，薄膜位相板を用いた場合の短所電子線損失を解決できる，Aharonov-Bohm (AB) 効果，を応用した位相板の開発を行った。AB効果位相板は極めて細い一本の棒磁石を絞り孔に橋かけし，磁石が作り出すベクトルポテンシャルを利用する。昨年度用いた電子線ホログラフィー用のパイプリズムに替り，10mm直径白金線から極細線を刀様にFIBで切り出しその刃の上に永久磁石材料を蒸着する棒磁石作製法を開発した。その結果，500nm幅×10mm厚×50mm長の日本刀様極細線を切り出し，その刃の上に10～20nm厚の磁石材料（コバルト，ニッケル）を蒸着できた。このAB効果位相板の性能テストを120kV位相差専用電顕で行い，位相変化を計測した。位相変化は棒磁石左右の平面間では差がありかつそれぞれの平面内では一様となることが期待されたが，左右差は認められたが，平面内一様性の達成には至らなかった。
DNA／RNA塩基配列の電子顕微鏡１分子計測法の開発
香山容子，永田麗子，永山國昭
片岡正典（計算科学研究センター）
DNA/RNAの塩基配列決定の高速化を図るため，電子顕微鏡技術を基軸に新しい方法論を開発している。この方法はi) 全核酸塩基の化学修飾による体積・電子密度差の増幅とDNA/RNAの一本鎖への解離，ii) 完全伸長した多数の一本鎖DNA/RNA分子の一方向整列によるアレイ作成，iii) アレイ化した一本鎖DNA/RNAの電顕による観察と識別，iv) 修飾塩基間のコントラスト差から塩基配列の解読，の4つの要素技術により成り立っている。TとUを除く3種の構成塩基全てを塩基選択的に化学修飾することに成功し，各塩基間の体積と電子密度差の増幅が可能となった。これらの修飾DNAを単層グラフェンまたは薄層グラファイトを基盤として担持し，背景信号を限りなく少なくして一重鎖DNA分子の電子顕微鏡観察を試みた。
膜タンパク質の構造解析
重松秀樹，Radostin DANEV，曽我部隆彰，富永真琴，永山國昭
飯田秀利（統合バイオ客員教授），本間道夫（名古屋大学大学院理学系研究科）
結晶化の困難な膜蛋白質の構造を電子顕微鏡像から決定する手法として単粒子解析に取り組んでいる。3種類 (TRPV4, MCA1, MCA2) の膜蛋白質については，組み換え発現系を構築し，精製蛋白質の構造を界面活性剤可溶化状態で構造解析を行った。その結果TRPV4については35Å分解能の立体構造が得られ，論文投稿中である。またMCA2についても24Å分解能の立体構造が得られ，学会発表行い，論文投稿を行った。また，新たに，Vibrio菌由来のモータ蛋白質複合体HBBについて，構造解析を始めた。氷包埋試料の単粒子解析および新たな試みとして低温位相差トモグラフィにも取り組んでいる。
Zernike位相差電子顕微鏡法の“複雑な”生物試料への応用
福田善之，Radostin DANEV，深澤有吾，重本隆一，永山國昭
これまでZernike位相差電子顕微鏡観察は蛋白質やウイルス等の小さい構造体に応用されてきたが，細胞や組織切片など“複雑”な試料には応用されていなかった。本研究ではガラス状に凍結した細胞，組織切片のZernike位相差電子顕微鏡観察を行った。従来使用している中心孔径700nmの位相板を応用したところ，位相差法により微細構造のコントラストは改善されるものの，短周期のハロの出現及び，観察像の粒状性などにより，微細構造をはっきりと観察することが出来なかった。そのため，Zernike位相板の中心孔径を従来の700nmから300nmに縮小したものを作製し，それを用いた位相差観察像の検討を行った。その結果，中心孔径を縮小することにより位相差法に伴うコントラストが増加するとともに，ハロの周期が長くなり，結果的に観察像へのハロの影響が抑えられることが確認できた。
通常電顕観察において，マウス海馬初代培養神経細胞急速凍結試料とマウス大脳皮質ガラス質凍結超薄切片では生体分子分布に基づく微細構造を低分解能でしか観察出来ない。中心孔径300nmのZernike位相板を使用することで，マウス海馬初代培養神経細胞急速凍結試料においては細胞内の様々な細胞骨格蛋白質の分布が，またマウス大脳皮質ガラス質凍結超薄切片では細胞骨格蛋白質や細胞膜間架橋分子などがより高い分解能で観察された。大脳皮質ガラス質凍結超薄切片では電子染色を行った樹脂包埋脳組織超薄切片と同程度のコントラストで微細構造を観察できた。本研究は生理学専攻の博士論文として提出され受理された。
脳組織凍結割断レプリカの二重標識電顕法の開発
Alexandre Loukanov，Radostin Danev，釜澤尚美，重本隆一，永山國昭
電子顕微鏡法はその高分解能性故に分子レベルでの定量的研究には幅広い応用可能性が残っている。本研究では以下の電子顕微鏡法につき定量化を行った。
i) 新規な光顕・電顕相関イメージングのための共通ラベル剤（標識薬）の開発：金属種の選択と粒子径の制御により多彩な発色が可能であるQ-dotを応用した。特にZnS, CdSeにつき，3～5nm径のQ-dotを合成し七色の発色を確かめた。
ii) 新規ラベル法に適した電子顕微鏡手法の開発：ZnS, CdSe等は，従来の金コロイドに比べ原子量が低く，電顕的に低コントラストである。そのため重金属を用いる電子染色試料や白金炭素レプリカ法への適用は不可能とされてきた（背景の方がQ-dotより高コントラストのため）。そこで白金という重金属を排する新しい低元素レプリカ手法，炭素レプリカ法を開発した。炭素膜に担持された受容体への抗体Q-dotラベル観察を可能とするため，走査透過電顕 (STEM) と元素弁別イメージング法(EDX) の組み合わせという新規手法を開発した。そのことにより，ZnS Q-dotでは5nm，CdSe Q-dotでは3nm，金コロイドでは1.4nmまでの微小ナノ粒子のラベル剤適用が可能となった。
iii) i)とii)を用いた神経細胞表面の受容体タイプ選択的標識法の開発：神経末端の受容体の種類（NMDAとAMDA）の弁別的ラベルがこの研究でのターゲットである。特に同一サイズのQ-dotまたは金コロイドをEDXに用いることで定量的に元素弁別でき，従来法のサイズ分布に伴う曖昧さを完全に払拭できた。本研究は生理学専攻の博士論文として提出され受理された。
位相差低温トモグラフィーの開発
Radostin Danev，永山國昭
CRESTの経費で導入された200kV位相差電顕 (JEM2200F)を用いて低温トモグラフィーの開発を行った。特に位相差法とトモグラフィーの組み合わせは世界最初の事例であったが両者の特質がシナージティックに働き約3nm分解能の立体的解析システムを構築できた。このシステムを各種蛋白質，各種ウィルスに適用し高いコントラストと高分解能の立体構造を得ることができた。
漢方薬-丹参-の灌流ラット顎下腺に対する水分泌促進機構
村上政隆
魏 睦新（南京医科大学第一付属医院 中医内科）
唾液分泌低下に対して治療効果のある漢方薬が多く知られているが，これらの薬物が直接唾液腺に作用するのかどうか？ また直接作用があるとすれば，唾液を誘発するのかあるいは唾液水分分泌速度を増強するのかを摘出ラット顎下腺の血管灌流標本を用い，水分分泌速度を測定し検討してきた。2005-2007年度に漢方薬20種類を検討し，15種類で唾液分泌の増強が観察された。雄性成体ラットから顎下腺を摘出，血管灌流標本を作製。分泌導管にカニューレを施し，これを電子天秤上のカップに導き，分泌された唾液重量を時間微分して分泌速度を求めた。漢方薬は，薬物は灌流液中に推定治療血液濃度で添加，遠沈後上清を0.45ミクロンフィルターを通したものを使用した。唾液分泌刺激の対照としてカルバコール0.2mMを用いた。
2008年度は，自発分泌を起した甘草と丹参について自律神経ブロッカーを用い，どの受容体が刺激を受けているかを検討した。その結果，アトロピンにより，甘草による水分分泌は完全に抑制され，甘草がムスカリン受容体を刺激していることが明らかになった。一方，丹参により誘発される水分泌はアトロピン投与でも抑制されず，フェントラミンでも抑制されなかった。このことは，丹参は，唾液腺で水分分泌を誘発するとされるムスカリン受容体もaアドレナリン受容体も刺激しないことになる。細胞内に移行せず，傍細胞経路を通過し分泌されるルシファ−イエロー蛍光色素の分泌時間経過を観察した。顎下腺ではカルバコールなどのムスカリン刺激により，水分泌とともに傍細胞経路が開く。0.2mMカルバコール刺激と丹参刺激を比較すると，水分は、丹参でカルバコ−ルより多く分泌された。一方，蛍光色素はカルバコ−ルの方が丹参より多く分泌された。以前報告 (Murakami, J. Physiol, 537: 899, 2001) のように傍細胞輸送経路には半径5Å以下の分子を通す小さな経路と色々な分子量の分子を通す大きな経路の二つがあることが推定されたが，今回用いた蛍光色素は後者の経路を通過すると考えられる。従って丹参は小さな経路をより開いたのではないかと考察され，丹参の唾液分泌増強のひとつに傍細胞経路の開放があげられた。細胞内Ca増加が傍細胞経路を開くことと関連する実験結果が共同研究でも示され，今後細胞内Caとの関係について詳細な実験を進めてゆく必要がある。
In vitroおよび In vivoにおける分泌唾液蛋白の相違
村上政隆
Massimo Castagnola, Chiara Fanali, Rosanna Inzitari, Irene Messana
（カトリック大学医学部ローマ校）
Alessandro Riva, Francesca Testa-Riva（カリアリ大学医学部細胞形態学）
Jörgen Ekström（イエリテボリ大学神経科学および生理科学部）
吉垣純子，杉谷博士（日本大学松戸歯学部生理学）
唾液腺から分泌されるタンパク質/ペプチドの種類は，高分解二次元電気泳動によると耳下腺では数百といわれる。耳下腺腺房細胞でのタンパク分泌経路は大きく，顆粒分泌とベシクル分泌の経路に大別されるが，唾液中のタンパク質/ペプチドがどの経路を使うかは定かではない。本プロジェクトは，ローマチームの質量分析技術，イエリテボリチ−ムの唾液腺in vivo耳下腺実験技術，生理研のin vitro摘出耳下腺唾液腺灌流，日大松戸歯学部チームの分泌顆粒精製技術が共同して，この問題に取り組んできた。ラット耳下腺からはPSP(rat parotidsecretory protein, Swiss Prot Code Q63471) が分泌される。まず，麻酔下のラットを用い耳介側頭神経（副交感）を電気刺激して10分毎，120分にわたり唾液を採取して，質量分析(RP-HLPC-ESI-MS) で分析すると，PSP由来の二つのペプチド（分子量，1211.7と928.5Da）を，前者はPSPのN端から1-12のアミノ酸からなるペプチド(PSPFr-A)，後者はN端から3-12のアミノ酸からなるペプチド(PSPFr-B)，と同定した。そして長時間刺激でPSPFr-Aは増加，反対にPSPFr-Bは減少することが分かった。摘出灌流耳下腺からの唾液でも同様の反応が見られ，これらのペプチドは循環血由来のペプチドではない事が裏付けられた。タンパク合成阻害剤を与えた耳下腺の唾液にはPSPFr-Aは見つからず，PSPFr-Bは減少した。タンパク分解酵素aprotininを与えたラットでは，PSPFr-B分泌はほとんど無くなった。一方PSPFr-Aは阻害剤を入れる前より増加した。一方，無刺激の場合には，精製した分泌顆粒にはPSPFr-AもPSPFr-Bペプチドも，見つからなかった。これらの結果は，顆粒経路とベシクル経路の少なくとも二つの経路関わるペプチド産生の問題であり，PSPFr-Aは，顆粒/ベシクル両経路の最初の切断産物である。PSPFr-Bはおそらく最後の段階で顆粒のPSPFr-Aより生成されると考えられた。裏づけには形態的な裏づけが必要とされる。将来的には他のペプチドについても解析を続けてゆく計画である。
エンドソーム－ゴルジ細胞内膜系の選別輸送のメカニズムと生理機能
大橋正人，三寶千秋
木下典行（基生研）
エンドソーム－ゴルジ系などの細胞内膜系が，極性細胞の形態形成シグナル制御において果たす役割を解析するため，上皮系細胞の未だ数の限られているエンドソーム－ゴルジ細胞内膜系マーカー分子の，FL-REX (fluorescence localization- based retrovirus-mediated expression cloning) 法による探索・同定を進めてきた。極性上皮細胞からcDNA -GFP融合ライブラリーを構築し，上皮細胞株に発現させ，エンドソーム－ゴルジ細胞内膜系様の局在を示す細胞をクローン化した。得られたGFP融合蛋白質を解析したところ，これらはもとになった細胞のcDNAライブラリー内容を反映すると考えられる特徴的な膜蛋白質群からなり，特定のGFP融合ライブラリーからは，発生における形態形成シグナル制御に関わっていることが既知である複数の膜蛋白質も得られた。また，特定の膜オルガネラに局在するいくつかの機能詳細不明の蛋白質を同定した。
これまでに，強制発現やアンチセンスモルフォリーノオリゴを用いた機能解析実験の結果，FL-REX法によりエンドソーム－ゴルジ系に局在することの判明した膜蛋白質の中から，初期発生に関与する新たな機能分子の候補を挙げることに成功した。また，これらの蛋白質の作用メカニズムを解明するため，蛋白質への変異導入により，エンドソーム－ゴルジへの局在シグナルとその制御についての解析が進んでいる。
