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大学共同利用機関法人自然科学研究機構生理学研究所

生理学研究所

実習コース詳細_コース08-13Course List

顕微鏡解析（電子顕微鏡・2光子・超解像・凍結切片）

08. クライオ電子顕微鏡によるタンパク質の構造解析

生体分子構造研究部門　（村田和義）

内容	クライオ電子顕微鏡によるタンパク質の構造解析を、実際の操作を通して習得します。具体的には、１）Vitrobotによるタンパク質試料からの氷包埋試料の作製とJEM2200FSによる確認２）電子顕微鏡Krios G4で高分解能電子顕微鏡像の収集、３）解析ソフトウエアRlion、CryoSPARCによる単粒子構造解析４）UCSF Chimeraによるボリュームレンダリング、原子モデルフィッティングを行います。
集合日時	7月 30日（火）　9:30
集合場所	生理研玄関（明大寺地区）
持ち物	上履（共用のスリッパはあります）筆記用具データ解析のためのWiFiが使えるノートPC
連絡事項	コース内で自己紹介（現在の研究内容など）を5分程度して頂きますので、そのPowerPointファイルをご用意ください。
スケジュール	7月 30日（火）氷包埋試料の作製 7月 31日（水）高分解能電子顕微鏡像の収集 8月 1日（木）単粒子構造解析 8月 2日（金）ボリュームレンダリングと原子モデルフィッティングと成果発表会

09. 電顕画像データセットを使った脳神経組織の３次元再構築

電子顕微鏡室　（窪田芳之、宮崎隆明）

内容	脳組織の連続超薄切片電子顕微鏡画像撮影法と神経細胞要素３次元再構築法を、講義と見学、および、実際の操作を通して修得します。具体的には１）ウルトラミクロトームを使った連続超薄切片の作製（講義と見学）２）走査型電子顕微鏡による連続電子顕微鏡画像の撮影（講義と見学）３）Image Jによるモンタージュ画像作成とアラインメント、VAST Liteによるマニュアルセグメンテーション（実習）４）神経要素（棘突起など）の各種形態データ計測（実習）を行います。
集合日時	7月 30日（火）　10:00
集合場所	生理研（山手地区）2号館 5階西側
持ち物	上履筆記用具 USBメモリ（記録したデータを持ち帰りたい場合）
連絡事項	初日に自己紹介（現在の研究内容など）を10分程度して頂きます。口頭、PowerPointや印刷資料（レジュメ）で説明いただくことも可能です。
スケジュール	7月 30日（火）連続超薄切片の作成・連続電顕画像の撮影に関する講義と見学 7月 31日（水）連続電顕画像の神経要素３次元再構築（実習） 8月 1日（木）連続電顕画像の神経要素３次元再構築（実習） 8月 2日（金）神経要素（棘突起など）の形態データ計測（実習）

10. ２光子顕微鏡による細胞内分子活性化のFRETイメージング

多光子顕微鏡室　（村越秀治、長澤裕太郎）

内容	２光子顕微鏡法は生体組織深部のイメージングに適しており、高空間分解能での蛍光観察や局所的な細胞刺激を可能にする最新の手法である。さらに２光子蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いたFRETイメージングによって、組織深部の細胞内の分子活性化を観察することができるため、細胞のいつ、どこで、どのような分子が働いているのかといった情報を知ることも可能になっている。　本実習では２光子蛍光顕微鏡や蛍光寿命イメージング、FRETについての基本的な知識を習得する。また、実際にラット海馬スライスの神経細胞や培養細胞（HeLa）にFRETセンサーを遺伝子導入（ウイルスインジェクション、リポフェクション）し、細胞への入力刺激時のシグナル伝達分子（CaMKIIや低分子量Gタンパク質）の活性化イメージングを行う。さらに得られたデータの解析をMatlabで行う。
集合日時	7月 30日（火）　9:00
集合場所	生理研（明大寺地区）　561号室　（多光子顕微鏡室）
持ち物	上履筆記用具 USBメモリ（記録したデータを持ち帰りたい場合）
連絡事項	動物実験教育訓練（オンライン）の受講が必要です。
スケジュール	7月 30日（火）スケジュール説明、懇親会海馬スライスへのアデノ随伴ウイルス導入海馬スライス作製見学＋実習 HeLa細胞に遺伝子導入（リポフェクション） 7月 31日（水） 2光子顕微鏡と2光子蛍光寿命イメージングの原理 HeLa細胞の2光子蛍光寿命イメージング（CaMKIIの活性化観察） HeLa細胞解析と動画作成海馬スライス発現確認 8月 1日（木）海馬スライスの2光子蛍光寿命イメージング（低分子量Gタンパク質の活性化観察） 8月 2日（金）海馬スライス神経細胞解析と動画作成＊最終日は14時ごろに終了する予定です。

11. 生体多細胞活動計測と操作

多細胞回路動態研究部門　（和氣弘明、山口裕嗣）

内容	本実習ではマウスを用いて ① in vivoイメージングを行うために必須である open skull法を初めとした様々な手術法、 ②ミクログリアなどの in vivoイメージング、 ③ 覚醒下での大脳皮質カルシウムイメージング、ホログラフィック顕微鏡を用いた細胞活動操作などを供覧する。
集合日時	7月 30日（火）　10:00
集合場所	生理研（明大寺地区）5階　（生体恒常性発達研究部門）
持ち物	上履きノートPC 白衣ノートと筆記用具データを持ち帰る場合は記憶媒体自己紹介で使用するPowerPointファイル（現在の研究内容などを3分程度で）
連絡事項	動物実験教育訓練（オンライン）の受講が必要です。
スケジュール	初日に説明します。

12. 先端蛍光顕微鏡法を用いた生理機能の可視化解析

バイオフォトニクス研究部門　（根本知己、石井宏和）

内容	生命科学研究で使用される基本的な方法論である光学顕微鏡、蛍光顕微鏡の基礎の理解を目指すと共に、先端の光学顕微鏡、特に、生体深部のイメージングに適した多光子顕微鏡や光の波長を越えた空間分解能を実現する超解像顕微鏡について講習する。特に各自の研究テーマを配慮して、（1）生体マウス脳のin vivoイメージング（2）概日性リズムのイメージング（3）株化細胞の3次元タイムラプス観察などの手技を体験する。申込時には予定されるご自身の研究テーマ、実験内容の希望等について記載をしてください。また持ち込みで観察をしたい場合には予め連絡をしてください。
集合日時	7月 30日（火）　9:00
集合場所	生理研（山手地区）2号館　8階東　（バイオフォトニクス研究部門）
持ち物	白衣上履筆記用具 USBメモリ（記録したデータを持ち帰りたい場合）自己紹介で使用するPowerPointファイル（現在の研究内容などを3分程度で）
連絡事項	初日にPowerPointファイルを使った自己紹介（現在の研究内容など）をしていただきます。動物実験教育訓練（オンライン）の受講が必要です。
スケジュール	7月 30日（火）午前　レクチャー、午後　実習 7月 31日（水）午前　レクチャー、午後　実習 8月 1日（木）午前　レクチャー、午後　実習 8月 2日（金）まとめ＊最終日は15時ごろに終了する予定です。

13. 培養細胞と組織凍結切片の蛍光免疫染色法

細胞構造研究部門　（泉裕士）

内容	タンパク質分子のはたらきを理解するうえで、その分子が細胞のどこに存在するかに関する情報は重要な示唆を与える。目的の分子のおよその局在は、すでに知られている各細胞構造のマーカー分子との共局在を指標とする免疫学的手法を用いた光学顕微鏡観察により決定できることが多い。ただし、免疫学的手法は抗体の良し悪しや細胞・組織の固定条件等で観察結果が大きく左右される場合があるため、得られた結果の解釈は慎重におこなう必要がある。　本コースでは、初心者を対象として、培養細胞及びマウス組織の新鮮凍結切片を用い、蛍光免疫染色法によるタンパク質分子の細胞内局在の可視化法と評価法について学ぶ。初歩的な実験手技であるが、多少の実験実習経験があることが望ましい。細胞培養の実技はコースに含まれない。
集合日時	7月 30日（火）　9:30
集合場所	生理研（山手地区）2号館　4階西　（細胞構造研究部門）
持ち物	上履筆記用具白衣 USBメモリあるいは記録用CD、DVD（データを持ち帰りたい場合）印刷したテキスト
連絡事項	USBメモリ持参の場合、ウィルスフリーであることをご確認下さい。 PC持参が望ましいです（必須ではありません）。動物実験教育訓練（オンライン）の受講が必要です。
スケジュール	7月 30日（火）本コースの概説、培養細胞の固定、蛍光免疫染色 7月 31日（水）蛍光顕微鏡観察、マウス組織の新鮮凍結サンプル作製 8月 1日（木）新鮮凍結切片作製、固定、蛍光免疫染色 8月 2日（金）蛍光顕微鏡観察、結果まとめ＊最終日は14時ごろに終了する予定です。

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