かつて岡崎統合バイオ永山研でゼルニケ位相差電顕を開発し、現在Max PlankInstituteのBaumeisterラボで新たな位相差電顕（ボルタ位相板）の開発に取り組んでいる両博士にセミナーをお願いしました。

多数のご来聴をお待ちしています。

演者１（3pm~）:福田義之
演題名：Improvement of contrast in Electron Cryo-Tomography by Volta Phase Plate

細胞における各分子の分布、及び「その場」での巨大分子複合体の形成過程に関する知見は細胞機能理解のために重要である。電子線クライオトモグラフィーは 生物試料を生理的条件に保持したまま、その三次元構造の解析を可能にする。しかしながら、電子線クライオトモグラフィーでは生物試料を構成する低原子番号 の元素に由来する観察像の低コントラストが問題である。　これまでに、クライオ透過電子顕微鏡による生物試料の観察像のコントラストを改善するために、様々な位相板が開発されてきた。それらの位相板の中でゼルニケ位相板は最も多く使用され、生物試料の形態、構造解析に貢献してきた。しかしながら、ゼルニケ位相差法では、コントラストの改善に伴う、フリンジの発生が知られている。そして、このフリンジが観察像の解釈を阻害する可能性が有るとして指摘されている。
　近年、透過電子顕微鏡用の新たな位相板として、ボルタ位相板が開発された。ゼルニケ位相板とは異なり、このボルタ位相差法ではコントラストの改善に伴う、フリンジが発生しない。そのため、クライオ透過電子顕微鏡を用いた各手法による細胞、ウイルス、タンパク質複合体などの構造解析に非常に有用であると期待される。
　我々は、電子線クライオトモグラフィーにおけるボルタ位相板の有用性を検討するために、急速凍結磁走性細菌を試料として、通常法とボルタ位相差法、エナジーフィルターの有無の4つの異なる組み合わせにおいて観察を行い、得られた観察像におけるコントラストの比較を行った。その結果、ボルタ位相板がエナジーフィルターよりも観察像のコントラスト向上に貢献していることが示された。
　さらに、ボルタ位相板を用いた急速初代培養神経細胞の電子線クライオトモグラフィーにおいて神経細胞内の26Sプロテアソーム分子を直接可視化することに成功した。そして、可視化された26Sプロテアソーム分子の平均化処理及び立体構造の分類を試みた。その結果「基底状態」と「基質処理状態」の2つの主要な立体構造を得られた。

Reference:Electron cryotomography of vitrified cells with a Volta phase plate.
Fukuda Y, Laugks U, Lučić V, Baumeister W, Danev R.
J Struct Biol. 2015 Mar 12. pii: S1047-8477(15)00058-1. doi:10.1016/j.jsb.2015.03.004.

演者２（4pm~）：Dr. Radostin Danev
演題名：Automated Cryo-tomography and Single Particle Analysis with the Volta Phase Plate

Recent years have shown an increased interest in the development and use of phase plates in cryo-EM. The oldest and the most productive type of phase plate is the thin film Zernike phase plate. It has been successfully used in cryo-tomography and single particle analysis applications. Despite its good performance the Zernike phase plate has a few pitfalls. One major practical hindrance is its short lifetime.
Typically within 10 days after being installed into the microscope its performance deteriorates to the point where it has to be exchanged.
 Another disadvantage of the Zernike phase plate is that it produces fringes around high-contrast features in the image, such as lipid membranes, support film edges etc. Despite its shortcomings the Zernike phase plate has been the main motivation and experience generator in the last years.
  In collaboration with the FEI Company we recently developed a new type of phase plate – the Volta phase plate. It addresses both shortcomings of the Zernike phase plate discussed above. Our tests indicate that the new phase plate lasts for more than six months inside the microscope. This is a big advantage in terms of servicing and up time of the microscope. The other big advantage of the new phase plate is that it produces fringe-free images which resemble in appearance light microscopy phase contrast images.
 The new phase plate was tested with the two main 3D cryo-EM techniques – cryo-tomography and single particle analysis. Comparing the results with what has been published shows that it performs significantly better than the thin film Zernike phase plate. The improvements are both in image appearance and resolution.

Reference:Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy.
Danev R, Buijsse B, Khoshouei M, Plitzko JM, Baumeister W.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Nov 4;111(44):15635-40. doi:10.1073/pnas.1418377111.