2016年度計画共同研究実施内容

　計画共同研究は，研究者の要請に基づいて生理学研究所が自らテーマを設定します。2007年度までは，「遺伝子操作モデル動物の生理学的，神経科学的研究」と「バイオ分子センサーと生理機能」の二つが行われました。2008年度からは，「多光子励起法を用いた細胞機能・形態の可視化解析」と「位相差低温電子顕微鏡の医学・生物学応用（2011年度から「先端電子顕微鏡の医学・生物応用」に改題）」が，2009年度からは「マウス・ラットの行動様式解析」が開始されました。また，2011年度から「マウス・ラットの行動代謝解析」が，2012年度から「霊長類への遺伝子導入実験」，「機能生命科学における揺らぎの研究」及び「脳情報の階層的研究」が，開始されました。さらに，2013年度から「ウイルスベクターを用いた神経系への遺伝子導入」が、2016年度から、「生体超分子複合体の精製と質量分析法による同定」が新設されました。いずれも現在最も高い関心が寄せられている領域であると同時に，生理学研究所が日本における研究の最先端を走っている分野でもあり，多くの共同研究の申請を期待しています。一方、自然科学研究機構のプロジェクトの終了に伴い「機能生命科学における揺らぎの研究」及び「脳情報の階層的研究」は、2015年度にて終了いたしました。

2012年度に、長期に渡り継続される申請課題に関して教授会および運営会議で話し合われた結果，以下のことが決定されました。

1. 申請計画は5年以内に終結する計画とし，明確な目的と実験計画を求める。ただし，5年間の進捗状況によりさらなる延長は可能である。
2. 申請課題名は具体的なものとし，包括的なテーマでは採択しない。
3. また，部門ごとに受け入れ件数を限る。一般共同研究：各研究部門・研究施設ごとに原則5件以内とすることが望ましい。計画共同研究：担当課題ごとに原則5件以内とすることが望ましい。

◇ 計画共同研究の詳細は，次の通りです。

「遺伝子操作モデル動物の生理学的，神経科学的研究」

　生理学及び脳科学の研究を推進する上で個体レベルでの解析は重要であり，遺伝子操作モデル動物は非常に有効な実験材料となります。モデル動物開発のための発生工学的技術の革新は近年とくに目覚ましく，日々，発展・進歩を遂げています。生理学・脳科学と発生工学の両方に精通した行動・代謝分子解析センターの遺伝子改変動物作製室が遺伝子操作モデル動物の作製技術を全国の研究者に提供することは，他機関の同種事業に比べても当該研究分野の発展に大きく貢献しています。共同利用研究に供するため，ラットとマウスにおいて，トランスジェニック（Tg）動物やノックアウト（KO）動物のような有用モデルの開発を支援しています。特にラットの遺伝子改変技術は，これまで困難を極めていましたが，最近，ES細胞やiPS細胞の樹立が確立され，ノックアウトラットの作製も可能となりました。同作製室においても，生殖系列寄与能を持つラットES細胞株ならびにiPS細胞株の樹立に成功し，これら幹細胞を使ってKOラット個体やノックイン（KI）ラット個体も獲得しました。2015年度は，研究所外5件の要請があり，合計で37系統の遺伝子改変マウス・ラットの作製を行ない，共同研究先へ提供しました。今後は，人工ヌクレアーゼを利用した新しいゲノム編集技術によるKO/KI動物の作製にも取り組み，その技術を広く提供できるよう努めていきます。

「マウス・ラットの行動様式解析」

　遺伝子改変動物を用いて，遺伝子と行動を直接関連づけられることが明らかとなってきました。このような研究においては多種類の行動実験を一定の方法に則って再現性よく行なうことが要求されます。このような実験を各施設で独立して行なうことは極めて困難であり，無駄が多くなります。生理学研究所では動物の行動様式のシステマティックな解析を全国の共同利用研究に供するために，行動・代謝分子解析センターに行動様式解析室を立ち上げました。この施設に日本におけるマウス行動学の権威である宮川博士を客員教授として迎え，2009年度から計画共同利用研究「マウス・ラットの行動様式解析」を開始しました。将来的にはラットの解析を行なう予定ですが，現在はマウスの解析を実施しています。
  2015年度は，研究所外との11件の計画共同研究，そして1件の所内共同研究を行ないました。マウス系統数としては7系統のマウスに対して網羅的行動テストバッテリーによる解析を行なったのに加え，8系統の遺伝子改変マウスあるいは薬物投与マウスについて，複数の行動テストによる解析を行いました。論文出版されたマウス系統については行動解析で得られた生データをマウス表現型データベース （http://www.mouse-phenotype.org/）で公開しています。また，行動様式解析室では実験のプロトコルを論文として発表することで，行動解析の効率化・標準化を推進しています。これまで4種類の行動テストについてJournal of Visualized Experiments誌に発表しています。発表した論文に対応した行動解析用ソフトウェアは以下のURLから無償で入手することができます：http://www.mouse-phenotype.org/software.html。
これらのソフトウェアを使用することで，取得画像に基づいた客観的な行動評価が手軽に行えるようになり，行動解析の効率化・標準化が進むことが期待されます。なお、行動様式解析室の閉鎖予定に伴い、2016年度は、新規申請の採択は行わず、既採択分の継続のみ実施することになりました。

「マウス・ラットの代謝生理機能解析」

代謝生理解析室は、2010年に発足、2011年より計画共同研究「マウス・ラットの代謝生理機能解析」を開始した。同室では、生理研内外の研究者が作成、保有する遺伝子改変動物を用いて以下の項目を測定している。

１）運動系を中心とした覚醒下での単一ニューロン活動などの神経活動の計測。
２）自由行動下における脳内特定部位での神経伝達物質の分泌計測。
３）フラビン及びヘモグロビン由来の内因性シグナルを利用した脳領域活動と膜電位感受性色素を用いた回路活動のイメージング。
４）自由行動下における摂食、エネルギー消費の計測。
５）自由行動下における体温、脈拍数、血圧の計測。
６）摘出灌流心臓または麻酔マウスを用いた心機能，循環血流量の測定

　2015年度は，外部機関と9件の共同研究を実施しました。

「先端電子顕微鏡の医学・生物学応用」

 　 本計画共同研究では，低温位相差電子顕微鏡（位相差電顕）と連続ブロック表面走査型電子顕微鏡（SBF-SEM）を初めとする当研究所が誇る最先端の電子顕微鏡技術を，医学，生物学のフィールドで有効に活用してもらうために実施します。位相差電顕は，生理学研究所で独自に開発されたもので，無染色の生物試料について，生（なま）に近い状態の構造を高コントラストで1 nm以下の分解能で観察できる性能を持ちます。主な観察対象は，急速凍結された無染色の蛋白質粒子，ウィルス，バクテリア，培養細胞，凍結組織切片などです。また，SBF-SEMは，樹脂に包埋された組織をダイヤモンドナイフで薄く削り，その表面に現れる構造を走査型電子顕微鏡（SEM）により連続的に記録して，試料の三次元構造を再構築する装置です。この方法は脳のように細胞が複雑に入り組んだ組織の三次元形態解析に有効です。数十nmの厚みで数千枚以上の画像を自動で取得することで，一辺が数百μmを越える三次元領域の構造を一度に可視化することができます。2015年度は位相差電顕に関連して5件，SBF-SEMに関連して20件の計画共同研究が行なわれました。
 

「多光子励起法を用いた細胞機能・形態の可視化解析」

　 2光子励起蛍光顕微鏡システムは，非侵襲性で組織深部の微細構造を組織や細胞が生きた状態で観察することができる光学顕微鏡です。近年，光学メーカー各社 が2光子システムを販売したことにより，国内外で急速に導入が進んでいます。しかしながら，2光子顕微鏡システムを使いこなすためには，顕微システムだけ でなく特殊な試料措置や経験が必要なケースがほとんどです。このような事情から，顕微鏡システムだけでなく，試料準備やプローブ選択を含めた高度な技術提 供ができる生理研が，共同利用可能な機関としては国内随一となっています。現在，3台の2光子励起顕微鏡（in vivoおよび組織切 片実験用）と2台の2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡が安定的に稼動しています。その性能は世界でトップクラスであり，レーザー光学系の独自の改良によ り，生体脳において約1ミリメートルの深部構造を1マイクロメートル以下の高解像度で観察できることのみならず，分子間の相互作用や活性化をイメージング することも可能となっています。このほかに，Qdotを利用した1分子イメージング観察システムの導入もできており，蛍光顕微鏡を利用した多彩なイメージ ングの共同研究への供与に取り組んでいます。

　特に，これまでに，生体内Ca²⁺イメージング技術の確立および同一 個体・同一微細構造の長期間繰り返し観察の技術の確立に成功しており，これらを利用し，脳，血管，骨組織における生体分子や細胞の可視化について共同研究 を実施しています。その他，生体恒常機能発達機構研究部門及び多光子顕微鏡室が研究室単位での共同研究を受け入れています。2015年度は4件の計画共同 研究を行ないました。さらに，将来の共同研究の可能性を検討するための予備的実験を4件行ないました。また，多光子励起顕微鏡システムの購入・自作の相 談，および共同研究の可能性についての詳細な相談を多数行ないました。また，多光子励起顕微鏡システムの見学には10件を超える来所者がありました。

「ウイルスベクターの作製・供与、および霊長類への遺伝子導入実験」

　ウイルスベクターを用いて霊長類の脳に遺伝子を導入し，機能分子の発現を制御したり神経活動を変化させたりする技術はこれまで困難とされてきましたが，今や有望な技術として注目されるようになってきました。しかしこのような研究を遂行するには，ベクターの開発，ベクター注入のための実験室など，多くの技術，設備を要します。これらの技術，設備を共同利用に供することにより，高次脳機能やその病態の解明を目指せるよう，2012年度から計画共同研究「霊長類への遺伝子導入実験」を開始しました。2013年度には5件，2014年度には5件の計画共同研究を行ないました。
  この実験の中心的な鍵を握るのは、ウイルスベクターの作成と使用です。また、げっ歯類等、霊長類以外への適用も求められます。そのため、2013年度から、計画共同研究「ウイルスベクターを用いた神経系への遺伝子導入」を開始しました。生理研ウイルスベクター開発室では，各種血清型のアデノ随伴ウイルスベクター，従来型のレンチウイルスベクター，神経路特異的な機能操作を可能にする高頻度逆行性レンチウイルスベクターなどを提供するとともに、より有用な新規ウイルスベクターの開発にも取り組んでいます。2014年度は，生理学研究所内外の研究室に延べ数で 100 件を超えるウイルスベクターの提供を行いました。2013年度は2件，2014年度は4件の計画共同研究を行ないました。
  2015年度からは、ふたつの計画共同研究を統合して「ウイルスベクターの作製・供与、および霊長類への遺伝子導入実験」として募集を行い、総計14件を実施しました。
これまでの成果としては、以下が挙げられます。マカクサル運動皮質損傷後の機能回復にともなう代償的運動出力経路の解明では，このような代償的経路の解析にウイルスベクターを用いる方法の検討を行い、中脳における神経回路操作を行うための対照実験の結果、霊長類の脳の深部への注入方法を確立できました。遺伝子改変サルモデルを用いた大脳基底核の機能と病態の解明においては，ウイルスベクターとイムノトキシン法を用いて，大脳基底核の神経経路のうちハイパー直接路（大脳皮質－視床下核路）の選択的除去に成功しました。霊長類脳遺伝子発現抑制実験へのPET分子イメージング法の応用では，ウイルスベクターを用いたRNA干渉による遺伝子発現抑制をPETで観察することに成功しました。
　2016年度には13件の実施が予定されています。

「生体超分子複合体の精製と質量分析法による同定」

  生体内でのタンパク質の機能を理解するためには、生体内での超分子複合体の構成タンパク質を正確に同定することが必要不可欠です。そのために、組織や細胞からタンパク質複合体を、特異性を重視して精製し、質量分析装置により構成タンパク質の同定や、免疫性疾患の自己抗体の標的抗原の同定を行う研究手法に対するニーズが高まっています。そのニーズに応えるために、新たに本計画研究を立ち上げ公募を開始し、2016年度は、x件を実施します。

2016年度採択表

(１)遺伝子操作モデル動物の作製と生理学的・神経科学的解析
(２)マウス・ラットの代謝生理機能解析
(３)先端電子顕微鏡の医学・生物学応用
(４)多光子励起法を用いた細胞機能・形態の可視化解析
(５) ウィルスベクターの作製・供与、および霊長類への遺伝子導入実験
(６)生体超分子複合体の精製と質量分析法による同定
 

過去の採択一覧・成果

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