2021年度計画共同研究実施内容

　計画共同研究は，研究者の要請に基づいて生理学研究所が自らテーマを設定します。2007年度までは，「遺伝子操作モデル動物の生理学的，神経科学的研究」と「バイオ分子センサーと生理機能」の二つが行われました。2008年度からは，「多光子励起法を用いた細胞機能・形態の可視化解析」と「位相差低温電子顕微鏡の医学・生物学応用（2011年度から「先端電子顕微鏡の医学・生物応用」に改題）」が，2009年度からは「マウス・ラットの行動様式解析」が開始されました。また，2011年度から「マウス・ラットの行動代謝解析」が，2012年度から「霊長類への遺伝子導入実験」，「機能生命科学における揺らぎの研究」及び「脳情報の階層的研究」が開始されました。さらに，2013年度から「ウイルスベクターを用いた神経系への遺伝子導入」が、2016年度から「生体超分子複合体の精製と質量分析法による同定」が、2017年度から「膜機能タンパク質ダイナミクスの解析」が、2021年度から、「多点走査型顕微鏡による多次元蛍光イメージング解析」と「神経活動ダイナミクスの解析による精神・神経疾患の病態解明」が新設されました。いずれも現在最も高い関心が寄せられている領域であると同時に，生理学研究所が日本における研究の最先端を走っている分野でもあり，多くの共同研究の申請を期待しています。一方、自然科学研究機構のプロジェクトの終了に伴い「機能生命科学における揺らぎの研究」及び「脳情報の階層的研究」は、2015年度にて終了いたしました。「マウス・ラットの行動様式解析室」については行動様式解析室の閉鎖予定に伴い、2016年度は、新規申請の採択は行わず既採択分の継続のみ実施して終了いたしました。

　2012年度に、長期に渡り継続される申請課題に関して教授会および運営会議で話し合われた結果，以下のことが決定されました。

1. 申請計画は5年以内に終結する計画とし，明確な目的と実験計画を求める。ただし，5年間の進捗状況によりさらなる延長は可能である。
2. 申請課題名は具体的なものとし，包括的なテーマでは採択しない。
3. また，部門ごとに受け入れ件数を限る。一般共同研究：各研究部門・研究施設ごとに原則5件以内とすることが望ましい。計画共同研究：担当課題ごとに原則5件以内とすることが望ましい。

◇ 計画共同研究の詳細は，次の通りです。

遺伝子操作モデル動物の生理学的，神経科学的研究

　遺伝子操作モデル動物は個体レベルでの遺伝子機能解析に非常に有効な実験材料として，広く生命科学分野において利用されています。モデル動物作製のための発生工学技術の発展は近年とくに目覚ましく，切断したい標的塩基配列を含むguide RNA (crRNA: tracrRNA) とCas9タンパク質を受精卵やES細胞に導入することでゲノム上の任意の配列を比較的容易に切断できる新ゲノム編集技術 (CRISPR/Cas9システム) が注目されています。行動・代謝分子解析センター 遺伝子改変動物作製室では常にCRISPR/Cas9システムのような最新の技術導入に挑戦し，内在遺伝子を改変したマウスおよびラット個体を同システムにより提供できる体制の整備を成し遂げました。生理学・脳科学と発生工学の両方に精通している当室スタッフは，遺伝子操作モデル動物の作製技術を全国の研究者に提供することを通し，当該研究分野の発展に大きく貢献してきました。計画共同利用研究ではラットとマウスの両方において，トランスジェニック (Tg) 動物やノックアウト/ノックイン (KO/KI) 動物の作製という形でモデル動物の開発を支援しています。2020年度は研究所外13件の要請に応え，計14系統の遺伝子改変マウス・ラットを作製し，共同研究先へと提供しました。今後も新しいゲノム編集技術によるKO/KI動物の作製にも取り組み，その技術を広く提供できるよう努めていきます。2021年度は12件実施予定です。

マウス・ラットの代謝生理機能解析

　代謝生理解析室は，2010年に発足，2011年より計画共同研究「マウス・ラットの代謝生理機能解析」を開始しました。同室では，生理研内外の研究者が作成，保有する遺伝子改変動物を用いて以下の項目を測定しています。

1）運動系を中心とした覚醒下での単一ニューロン活動などの神経活動の計測。
2) フラビン及びヘモグロビン由来の内因性シグナルを利用した脳領域活動と膜電位感受性色素を用いた回路活動のイメージング。
3）自由行動下における摂食，エネルギー消費の計測。
4）自由行動下における体温，脈拍数，血圧の計測。
5）麻酔マウスを用いた臓器形態－機能連関（肝・腎・血管）、4次元心機能変化，微小循環血流量（脳・臍帯）の非侵襲的超音波イメージング。
6) 円形温度グラジエント装置によるマウス温度嗜好性解析。

2020年度は外部機関と11件の共同研究を実施しました。2021年度も11件実施予定です。

先端電子顕微鏡の医学・生物学応用

　本計画共同研究では，低温位相差電子顕微鏡（位相差電顕）と連続ブロック表面走査型電子顕微鏡（SBF-SEM）を初めとする当研究所が誇る最先端の電子顕微鏡技術を，医学，生物学のフィールドで有効に活用してもらうために実施します。位相差電顕は，生理学研究所で独自に開発されたもので，無染色の生物試料について，生（なま）に近い状態の構造を高コントラストで1 nm以下の分解能で観察できる性能を持ちます。主な観察対象は，急速凍結された無染色の蛋白質粒子，ウィルス，バクテリア，培養細胞，凍結組織切片などです。また，SBF-SEMは，樹脂に包埋された組織をダイヤモンドナイフで薄く削り，その表面に現れる構造を走査型電子顕微鏡（SEM）により連続的に記録して，試料の三次元構造を再構築する装置です。この方法は脳のように細胞が複雑に入り組んだ組織の三次元形態解析に有効です。数十nmの厚みで数千枚以上の画像を自動で取得することで，一辺が数十μmを越える三次元領域の構造を一度に可視化することができます。2020年度は22件の計画共同研究が行なわれ、2021年度は18件が予定されています。

多光子励起法を用いた細胞機能・形態の可視化解析

　2光子励起蛍光顕微鏡システムは，非侵襲性で組織深部の微細構造を組織や細胞が生きた状態で観察することができる光学顕微鏡です。近年，光学メーカー各社が2光子システムを販売したことにより，国内外で急速に導入が進んでいます。しかしながら，2光子顕微鏡システムを使いこなすためには，顕微システムだけでなく特殊な試料措置や経験が必要なケースがほとんどです。このような事情から，顕微鏡システムだけでなく，試料準備やプローブ選択を含めた高度な技術提供ができる生理研が，共同利用可能な機関としては国内随一となっています。現在，3台の2光子励起顕微鏡（in vivoおよび組織切片実験用）と2台の2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡（FRETイメージングによりタンパク質間結合や分子活性化イメージングが可能）が安定的に稼動しています。その性能は世界でトップクラスであり，レーザー光学系の独自の改良により，生体脳において約1ミリメートルの深部構造を1マイクロメートル以下の高解像度で観察できることのみならず，分子間の相互作用や活性化をイメージングすることも可能となっており、多彩な光学顕微鏡イメージングの共同研究への供与に取り組んでいます。
また，これまでに，生体内C^a2+イメージング技術の確立および同一個体・同一微細構造の長期間繰り返し観察の技術の確立に成功しており，これらを利用し，脳，血管，骨組織における生体分子や細胞の可視化について共同研究を実施しています。その他，生体恒常性発達研究部門及び多光子顕微鏡室が研究室単位での共同研究を受け入れています。2020年度は3件の計画共同研究を行ないました。2021年度は3件を予定しています。また，多光子励起顕微鏡システムの購入・自作の相談，および共同研究の可能性についての詳細な相談を多数行ないました。
 

ウイルスベクターの作製・供与、および霊長類への遺伝子導入
実験

　ウイルスベクターを用いて霊長類の脳に遺伝子を導入し，機能分子の発現を制御したり神経活動を変化させたりする技術はこれまで困難とされてきましたが，今や有望な技術として注目されるようになってきました。しかしこのような研究を遂行するには，ベクターの開発，ベクター注入のための実験室など，多くの技術，設備を要します。これらの技術，設備を共同利用に供することにより，高次脳機能やその病態の解明を目指せるよう，2012年度から計画共同研究「霊長類への遺伝子導入実験」を開始しました。2013年度には5件，2014年度には5件の計画共同研究を行ないました。
この実験の中心的な鍵を握るのは、ウイルスベクターの作成と使用です。また、げっ歯類等、霊長類以外への適用も求められます。そのため、2013年度から、計画共同研究「ウイルスベクターを用いた神経系への遺伝子導入」を開始しました。生理研ウイルスベクター開発室では，各種血清型のアデノ随伴ウイルスベクター，従来型のレンチウイルスベクター，神経路特異的な機能操作を可能にする高頻度逆行性レンチウイルスベクターなどを提供するとともに、より有用な新規ウイルスベクターの開発にも取り組んでいます。2014年度までに，生理学研究所内外の研究室に延べ数で 100 件を超えるウイルスベクターの提供を行いました。2013年度は2件，2014年度は4件の計画共同研究を行ないました。
2015年度からは、ふたつの計画共同研究を統合して「ウイルスベクターの作製・供与、および霊長類への遺伝子導入実験」として募集を行い、総計14件を実施しました。
これまでの成果としては、以下が挙げられます。

１）マカクサル脊髄損傷後の機能回復にともなう代償的運動出力経路の解明では，ウイルスベクターによる経路選択的操作が中心的な役割を果たしました。
２）ウイルスベクターを利用することによって、ラットの前頭皮質5層における興奮性細胞と抑制性細胞からなる神経回路の特性が明らかになりました。
３）ウイルスベクターを利用して、脂肪と炭水化物の食べ分けを決める神経細胞がマウスで同定されました。
現在は管理上の簡便さから、P1Aで扱えるAAVベクターを中心に用いています。2018 年度には4 件の計画共同研究が採択され、マカクサル、マーモセットを用い、主に運動皮質•脊髄の機能について光遺伝学的解析を行っています。2020年度には18件を行い、2021年度は19件が予定されています。

生体超分子複合体の精製と質量分析法による同定

　生体内でのタンパク質の機能を理解するためには、生体内での超分子複合体の構成タンパク質を正確に同定することが必要不可欠です。そのために、組織や細胞からタンパク質複合体を、特異性を重視して精製し、質量分析装置により構成タンパク質の同定や、自己免疫性疾患の自己抗体の標的抗原の同定を行う研究手法に対するニーズが高まっています。2018, 2019, 2020年は各1件実施しました。2021年度は、2件を予定しています。

膜機能タンパク質ダイナミクスの解析

多点走査型顕微鏡による多次元蛍光イメージング解析

神経活動ダイナミクスの解析による精神・神経疾患の病態解明

2021年度採択課題一覧

①遺伝子操作モデル動物の作製と生理学的・神経科学的解析
②マウス・ラットの代謝生理機能解析
③先端電子顕微鏡の医学・生物学応用
④多光子励起法を用いた細胞機能・形態の可視化解析
⑤ウィルスベクターの作製・供与、および霊長類への遺伝子導入実験
⑥生体超分子複合体の精製と質量分析法による同定
⑦膜機能タンパク質ダイナミクスの解析
⑧多点走査型顕微鏡による多次元蛍光イメージング解析
⑨神経活動ダイナミクスの解析による精神・神経疾患の病態解明
 

過去の採択一覧・成果

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